T-LNSI 008-2024 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

ICS11.020CCSC05HumanumbilicalcordIT/LNSI008-2024 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4符號和縮略語 6檢驗(yàn)方法 7檢驗(yàn)規(guī)則 9標(biāo)簽 10包裝、儲存及運(yùn)輸 11廢棄物處理 附錄A（規(guī)范性）細(xì)胞存活率檢測細(xì)胞計(jì)數(shù)法 10附錄B（規(guī)范性）細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測流式細(xì)胞法 12附錄C（規(guī)范性）成骨分化檢測茜素紅S染色法 14附錄D（規(guī)范性）成脂分化檢測油紅O染色法 16附錄E（規(guī)范性）成軟骨分化檢測阿爾新藍(lán)染色法 18附錄F（規(guī)范性）成瘤性檢測免疫缺陷小鼠檢測法 20附錄G（規(guī)范性）干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖抑制檢測干細(xì)胞共培養(yǎng)法 22T/LNSI008-2024本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化的文件結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件由沈陽艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司、沈陽市再生生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提出。本文件由遼寧省免疫學(xué)會歸口。本文件起草單位：沈陽艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司、中國醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究室、沈陽干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、遼寧艾米奧干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院、遼寧省細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會、遼寧省生物技術(shù)協(xié)會、沈陽市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟、沈陽藥科大學(xué)、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院、艾米奧國際干細(xì)胞醫(yī)院。本文件主要起草人：龐希寧、龐然、施萍、單風(fēng)平、王莉莎、赫甡、宋揚(yáng)、徐東芬、荊晶、姜雯宇、高航、謝光麟、邵錫柱、王竟、孟濤、張美玲、聶宏光、郎宏鑫、劉曉玉、王喜良、張濤、趙峰、張殿寶、王瑞、李彩虹、李宏圖、潘長偉、孔娟、王哲、王蔚、殷軍、郭然、張寧、李曉航。1T/LNSI008-2024人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞本文件規(guī)定了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的技術(shù)要求、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、使用說明、標(biāo)簽、包裝、儲存、運(yùn)輸和廢棄物處理要求。本文件適用于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生產(chǎn)和檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。WS213丙型肝炎診斷WS273梅毒診斷WS293-2019《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》T/CSCB0001-2022《人干細(xì)胞研究倫理審查技術(shù)規(guī)范》GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則中華人民共和國藥典（2020年版）全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1間充質(zhì)干細(xì)胞mesenchymalstemcells2T/LNSI008-2024主要來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，廣泛存在于全是多種組織中，可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，并在特定條件下分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。3.2人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞humanumbilicalcordmesenchymalstemcells來源于人臍帶華氏膠組織，貼壁培養(yǎng)后呈紡錘形和梭形的成纖維細(xì)胞態(tài)，可在體外自我更新并具有成骨、成脂、成軟骨等分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。4符號和縮略語下列符號和縮略語適用于本文件。CD——分化簇（ClusterofDifferentiation）DNA——脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）EBV——皰疹病毒（Epstein-BarVirus）HBV——乙型病毒性肝炎（HepatitisBVirus）HCMV——人巨細(xì)胞病毒（HumanCytomegalovirus）HCV——丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV——人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HLA-DR——人類白細(xì)胞抗原-DR（HumanLeukocyteAntigen-DR）HTLV——人類嗜T細(xì)胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）IDO——吲哚胺2,3-雙加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase）IFN-γ——干擾素-γ（Interferon-γ)TNF-α——腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α)PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）STR——短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemRepeat）TP——梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）5技術(shù)要求3T/LNSI008-20245.1原材料和輔料5.1.1應(yīng)符合T/CSCB0001-2022要求。5.1.2應(yīng)建立供者細(xì)胞采集的供者評估與篩選標(biāo)準(zhǔn)、采集方法、運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)和交接標(biāo)準(zhǔn)，保證供者和細(xì)胞的安全。5.1.3供體應(yīng)篩查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV和TP，并記錄結(jié)果。5.2分離與培養(yǎng)方法5.2.1分離及提取采用組織塊貼壁法從臍帶華氏膠組織中分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)。5.2.2人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞換液根據(jù)細(xì)胞的生長情況換液。5.2.3人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代傳代操作應(yīng)密度適宜、及時(shí)、迅速。5.2.4人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存凍存細(xì)胞程序降溫后置液氮中保存。5.2.5人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇取出凍存管進(jìn)行快速融化，離心洗滌后進(jìn)行培養(yǎng)。5.2.6人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞溶液人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞溶液為均質(zhì)狀態(tài)，無絮狀沉淀，細(xì)胞存活率≥90％。5.3關(guān)鍵質(zhì)量屬性5.3.1細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時(shí)呈紡錘形和梭形的成纖維細(xì)胞態(tài)，形態(tài)均一。4T/LNSI008-20245.3.2染色體核型正常核型應(yīng)為46,XX或46,XY且400-550條段階段未見染色體異常。5.3.3細(xì)胞存活率未凍存細(xì)胞存活率≥90%且凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率≥70%。5.3.4細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD105、CD73、CD90陽性率均≥95%；CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR陽性率≤2%。5.3.5三系分化具有成骨、成脂、成軟骨的分化潛能。5.3.6成瘤性免疫缺陷動物（如小鼠）體內(nèi)成瘤試驗(yàn)結(jié)果為陰性。5.3.7微生物真菌、細(xì)菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP為陰性。5.3.8干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖抑制應(yīng)滿足下列要求：——共培養(yǎng)組與陽性對照組相比，白介素6、腫瘤壞死因子α表達(dá)下調(diào)，白介素10表達(dá)上調(diào)；——共培養(yǎng)組與陽性對照組相比，淋巴細(xì)胞增殖被顯著抑制；——共培養(yǎng)組與陽性對照組相比，淋巴細(xì)胞亞群輔助性T細(xì)胞上調(diào)，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞下調(diào)。5.4過程控制5.4.1擴(kuò)增、凍存、復(fù)蘇等過程控制應(yīng)符合T/CSCB0001-2022要求。5.4.2細(xì)胞STR檢測結(jié)果應(yīng)與供體細(xì)胞保持一致。5T/LNSI008-20246檢驗(yàn)方法6.1細(xì)胞形態(tài)二維培養(yǎng)條件下，用明視場細(xì)胞顯微鏡×40倍進(jìn)行觀察。6.2染色體核型按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”項(xiàng)檢驗(yàn)。6.3細(xì)胞存活率按照附錄A的方法檢驗(yàn)。6.4細(xì)胞表面標(biāo)志物按照附錄B的方法檢驗(yàn)。6.5三系分化6.5.1成骨分化按照附錄C的方法檢驗(yàn)。6.5.2成脂分化按照附錄D的方法檢驗(yàn)。6.5.3成軟骨分化按照附錄E的方法檢驗(yàn)。6.6成瘤性按照附錄F的方法檢驗(yàn)。6.7微生物6.7.1真菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項(xiàng)檢測。6T/LNSI008-20246.7.2細(xì)菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項(xiàng)檢測。6.7.3支原體按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3301無菌檢查法”項(xiàng)檢測。6.7.4HBV按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》核酸法檢驗(yàn)。6.7.5HCV按照WS213核酸法檢驗(yàn)。6.7.6HIV按照WS293-2019核酸法檢驗(yàn)。6.7.7HTLV按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》核酸法檢驗(yàn)。6.7.8EBV按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》核酸法檢驗(yàn)。6.7.9HCMV按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》核酸法檢驗(yàn)。6.7.10TP按照WS273核酸法檢驗(yàn)。6.8干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖抑制檢測按照附錄G的方法檢測。7檢驗(yàn)規(guī)則7.1抽樣方法和數(shù)量7T/LNSI008-20247.1.1在一個(gè)生產(chǎn)周期中，同一生產(chǎn)線、同一來源、同一代次、同一方法制備出來的產(chǎn)品為一批。7.1.2在同一批的產(chǎn)品中隨機(jī)抽取3個(gè)最小包裝單元。7.2出廠檢驗(yàn)7.2.1每批產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行出廠檢驗(yàn)，并附檢驗(yàn)報(bào)告。7.2.2出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)包括5.3規(guī)定的所有項(xiàng)目。7.3復(fù)核檢驗(yàn)若客戶需要，應(yīng)由第三方專業(yè)細(xì)胞檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)，檢驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)包括第5章規(guī)定的所有項(xiàng)目。7.4判定規(guī)則7.4.1出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目全部符合5.3規(guī)定，判定為合格品；有1項(xiàng)及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合格品。7.4.2復(fù)核檢驗(yàn)項(xiàng)目全部符合5.3規(guī)定，判定為合格品；有1項(xiàng)及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合格品。8使用說明應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：c）細(xì)胞數(shù)量；e）生產(chǎn)批號；f）生產(chǎn)組織；i）使用方法；8T/LNSI008-2024j）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號；k）生產(chǎn)地址；l）聯(lián)系方式；n）注意事項(xiàng)。注：根據(jù)用戶需求，可標(biāo)注內(nèi)毒素含量。9標(biāo)簽應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：c）細(xì)胞數(shù)量；e）生產(chǎn)組織；f）生產(chǎn)日期。10包裝、儲存及運(yùn)輸10.1包裝應(yīng)選擇對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性無影響的袋或瓶中，應(yīng)選用100毫升0.9%生理鹽水袋或瓶。10.2儲存10.2.1應(yīng)符合T/CSCB0001-2022要求。10.2.2應(yīng)在低于-130℃環(huán)境下儲存。10.3運(yùn)輸10.3.1應(yīng)符合T/CSCB0001-2022要求。10.3.2凍存的細(xì)胞應(yīng)在干冰或低于-130℃條件下運(yùn)輸，非凍存細(xì)胞建議在2℃~8℃下運(yùn)輸。9T/LNSI008-202411廢棄物處理人臍帶間充干細(xì)胞生產(chǎn)和檢測過程中生產(chǎn)的廢棄物應(yīng)按照T/CSCB0001-2022中的規(guī)定處理。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）細(xì)胞存活率檢測細(xì)胞計(jì)數(shù)法A.1儀器和設(shè)備A.1.1明視場顯微鏡。A.1.2血球計(jì)數(shù)板。A.2試劑除特殊說明外，所用試劑均為分析純，檢測用水均為18.2MΩ去離子水。A.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。A.2.2臺盼藍(lán)染液：使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液（A.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。A.3檢測步驟A.3.1細(xì)胞懸液制備收集待檢測細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（A.2.1）配制細(xì)胞懸液，稀釋至合適的濃度。每個(gè)血球計(jì)數(shù)板（A.1.2）的1mm2的方格中的細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)為20個(gè)~50個(gè)細(xì)胞。如果高于200個(gè)細(xì)胞，則需要進(jìn)行稀釋。A.3.2細(xì)胞染色按1:1的體積比將臺盼藍(lán)染液（A.2.2）與細(xì)胞懸液（A.3.1）混合均勻。A.3.3細(xì)胞計(jì)數(shù)將蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)板（A.1.2）計(jì)數(shù)槽上，取10μL混合液（A.3.2）滴在一側(cè)計(jì)數(shù)室的蓋玻片邊緣，另取10μL混合液，滴在另一側(cè)計(jì)數(shù)室的蓋玻片邊緣，使混合液充滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間，靜止30s，將計(jì)數(shù)板置明視場顯微鏡（A.1.1）下對被染色的細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。對16×25規(guī)格的計(jì)數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個(gè)1mm2的中格（即100個(gè)小格）計(jì)數(shù)。對25×16規(guī)格的計(jì)數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下和中央5個(gè)中格（即80個(gè)小格）計(jì)數(shù)。當(dāng)遇到位于大格線上的細(xì)胞，一般只計(jì)數(shù)大方格的上方和左線上的細(xì)胞（或只計(jì)數(shù)下方和右方線上的細(xì)T/LNSI008-2024胞）。按步驟A.3.2~A.3.3在重復(fù)測定一個(gè)樣品。A.3.4細(xì)胞存活率計(jì)算A.4計(jì)算與分析細(xì)胞存活率按式（A.1）進(jìn)行計(jì)算：X=(M-S)/X×100%.........................................（A.1）式中：X—細(xì)胞存活率；M—細(xì)胞總數(shù)；S—染色的細(xì)胞數(shù)。計(jì)算兩次計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率結(jié)果的平均值，記為細(xì)胞平均存活率。A.5精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的10%。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測流式細(xì)胞法B.1儀器和設(shè)備B.1.1流式細(xì)胞儀。B.1.2水平離心機(jī)。B.1.3電子天平。B.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。B.2.1磷酸鹽緩沖液：pH7.4。B.2.2牛血清白蛋白（BSA）：純度≥98%。B.2.3疊氮鈉（NaN3）。B.2.4抗人CD105、CD73、CD90、CD11b、CD19、CD31、CD45、HLA-DR抗體及同型對照抗體。B.2.5按照相應(yīng)要求使用電子天平（B.1.3）配置流式檢測所需的液體：洗滌液、抗體稀釋液。B.3樣品保存洗滌液和標(biāo)記后的樣品于2℃~8℃保存。相關(guān)抗體遵照說明書保存。B.4檢測步驟B.4.1樣品準(zhǔn)備收集細(xì)胞，使用水平離心機(jī)（B.1.2）300g離心4min，棄上清。然后，用洗滌液清洗一遍，使用水平離心機(jī)（B.1.2）300g離心4min，棄上清。B.4.2抗體孵育按照抗體說明書進(jìn)行稀釋使用?？贵w孵育結(jié)束后用洗滌液清洗兩遍，使用水平離心機(jī)（B.1.2）300g離心4min，棄上清。T/LNSI008-2024B.4.3過濾上機(jī)用洗滌液重懸細(xì)胞，然后通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀（B.1.1）應(yīng)用手冊上機(jī)檢測。B.4.4圈門設(shè)定原則首先根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1，排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，然后根據(jù)Isotype對照組熒光強(qiáng)度，在分群1的基礎(chǔ)上畫出陽性細(xì)胞群2，排除沒有被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞。抗體Isotype作為陰性對照。B.5結(jié)果分析得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）成骨分化檢測茜素紅S染色法C.1儀器和設(shè)備C.1.1血球計(jì)數(shù)板。C.1.2明視場顯微鏡。C.1.3水平離心機(jī)。C.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。C.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。C.2.2消化酶。C.2.3臺盼藍(lán)染液：使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液（C.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。C.2.4成骨誘導(dǎo)液。C.2.5茜素紅S染色試劑盒。C.3檢測步驟C.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備C.3.1.1細(xì)胞消化使用水平離心機(jī)（C.1.3）離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團(tuán)塊。C.3.1.2細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計(jì)數(shù)板（C.1.1）及明視場顯微鏡（C.1.2）計(jì)算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。C.3.2細(xì)胞接種并誘導(dǎo)細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成骨誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14d~21d。T/LNSI008-2024C.3.3鈣結(jié)節(jié)染色鈣結(jié)節(jié)染色根據(jù)茜素紅S染色試劑盒說明書進(jìn)行。C.4結(jié)果分析顯微鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）成脂分化檢測油紅O染色法D.1儀器和設(shè)備D.1.1血球計(jì)數(shù)板。D.1.2明視場顯微鏡。D.1.3水平離心機(jī)。D.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。D.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。D.2.2消化酶。D.2.3臺盼藍(lán)染液：使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液（D.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。D.2.4成脂誘導(dǎo)液。D.2.5油紅O染色試劑盒。D.3檢測步驟D.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備D.3.1.1細(xì)胞消化使用水平離心機(jī)（D.1.3）離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團(tuán)塊。D.3.1.2細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計(jì)數(shù)板（D.1.1）及明視場顯微鏡（D.1.2）計(jì)算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。D.3.2細(xì)胞接種并誘導(dǎo)細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成脂誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14d~21d。T/LNSI008-2024D.3.3脂滴染色脂滴染色根據(jù)油紅O染色試劑盒說明書進(jìn)行。D.4結(jié)果分析顯微鏡下可見橙紅色的脂滴，脂肪細(xì)胞中含大小不等的脂滴。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）成軟骨分化檢測阿爾新藍(lán)染色法E.1儀器和設(shè)備E.1.1血球計(jì)數(shù)板。E.1.2明視場顯微鏡。E.1.3水平離心機(jī)。E.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。E.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。E.2.2消化酶。E.2.3臺盼藍(lán)染液：使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液（E.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。E.2.4成軟骨誘導(dǎo)液。E.2.5阿爾新藍(lán)染色試劑盒。E.3檢測步驟E.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備E.3.1.1細(xì)胞消化使用水平離心機(jī)（E.1.3）離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團(tuán)塊。E.3.1.2細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計(jì)數(shù)板（E.1.1）及明視場顯微鏡（E.1.2）計(jì)算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。T/LNSI008-2024E.3.2細(xì)胞接種并誘導(dǎo)細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成骨誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14d~21d。E.3.3軟骨細(xì)胞外基質(zhì)染色軟骨細(xì)胞外基質(zhì)染色根據(jù)阿爾斯蘭染色試劑盒說明書進(jìn)行。E.4結(jié)果分析顯微鏡下可深藍(lán)色的軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)。T/LNSI008-2024（規(guī)范性）成瘤性檢測免疫缺陷小鼠檢測法F.1儀器和設(shè)備F.1.1血球計(jì)數(shù)板。F.1.2明視場顯微鏡。F.1.3水平離心機(jī)。F.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。F.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。F.2.2消化酶。F.2.3臺盼藍(lán)染液：使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液（F.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。F.3檢測步驟F.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備F.3.1.1細(xì)胞消化使用水平離心機(jī)（F.1.3）離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團(tuán)塊。F.3.1.2細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計(jì)數(shù)板（F.1.1）及明視場顯微鏡（F.1.2）計(jì)算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。F.3.2細(xì)胞移植將1×107個(gè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞注射到6至8周齡的免疫缺陷型小鼠皮下，設(shè)置空白對照組（空白組注射與產(chǎn)品對應(yīng)的溶媒）、陰性對照組（人二倍體細(xì)胞）、陽性對照組（人腫瘤細(xì)胞系、按照腫瘤T/LNSI008-2024細(xì)胞系接種要求的數(shù)量注射）。F.3.3腫瘤觀察接種后觀察16周，每周測量體重、腫瘤大小。若荷瘤小鼠腫瘤超過2000mm3或者腫瘤潰爛或體重下降，可考慮執(zhí)行人道終點(diǎn)。16周后剝離小鼠身上腫瘤，行大體觀察，瘤體稱重，計(jì)算成瘤率。F.4結(jié)果分析成瘤率按式（F.1）進(jìn)行計(jì)算：Z=N/M×100%.................................（F.1）式中：Z—成瘤率；M—接種小鼠總數(shù)；N—荷瘤小鼠總數(shù)。T/LNSI008-2024干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖抑制檢測干細(xì)胞共培養(yǎng)法G.1儀器和設(shè)備G.1.1血球計(jì)數(shù)板。G.1.2二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱。G.1.3水平離心機(jī)。G.1.448孔細(xì)胞培養(yǎng)板。G.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。G.2.1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基。G.2