DB34T∕ 2785-2016 油菜抗根腫病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)程

油菜抗根腫病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)程TechnicalRegulationsforArtificialInoculationofHYPERLINK安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所。本標(biāo)準(zhǔn)參與起草單位：安徽省黃山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：費(fèi)維新、胡寶成、李強(qiáng)生、侯樹敏、陳鳳祥、榮松柏、王淑芬、初明光、江瑩芬、郝仲萍。1油菜抗根腫病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了油菜品種根腫病抗性鑒定依據(jù)、實(shí)驗(yàn)菌株的擴(kuò)繁與保存、育苗基質(zhì)的配置、接種液的制備、接種苗的培養(yǎng)、人工接種技術(shù)和抗性評(píng)價(jià)方法等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于油菜品種資源根腫病的抗性鑒定及評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB15981消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)SN/T2632微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。一種能夠被病原菌侵染并引起病害的生物體。病原菌株pathogenicisolate從植物發(fā)病部位通過人工培養(yǎng)、純化、再接種和分離等方法獲得的病原菌的分離培養(yǎng)物。3.3休眠孢子懸浮液restingsporessuspension病菌休眠孢子均勻分散于水中不下沉，與水混合形成孢子懸浮液。接種濃度inoculumsconcentration用于人工接種的單位體積內(nèi)病菌休眠孢子的數(shù)量。2DB34/T2785—根腫病clubrootdiseasePlasmodiophoromycetes,根腫菌目Plasmodiophorales。由Plasmodiophorabrassicae病菌侵染引苗期油菜根腫病分級(jí)標(biāo)推詳見附豪流使用，請(qǐng)勿傳播或其他用途電子天平(感量0.01g),移液器，離心管，吸管，三角瓶，醫(yī)用血球計(jì)，育苗盤及托盤。6主要試劑與材料75%乙醇酒精，濃鹽酸，根腫菌的主要致病生理小種病原菌株，油菜根腫病感病對(duì)照品種Westar和抗病對(duì)照品種Mendel,泥炭土，蛭石，珍珠巖。37實(shí)驗(yàn)菌株的擴(kuò)繁實(shí)驗(yàn)用菌株用油菜感病品種Westar或速生2號(hào)接種擴(kuò)繁，方法同人工接種，接種后60天(d)收獲腫根，并用自來水洗凈后登記繁殖寄主品種、生理小種類型、日期、人員等信息，并于-20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?育苗基質(zhì)的配置使用的營養(yǎng)基質(zhì)為接種用專用配方土，主要成分為泥炭土、蛭石、珍珠巖，并按照體積比1:1:1均勻混合。在使用前將配置的營養(yǎng)基質(zhì)先用高壓滅菌鍋滅菌處理(121℃,30min),參照GB15981標(biāo)準(zhǔn)；然后將滅菌的營養(yǎng)基質(zhì)分裝入50孔(每孔100ml)的育苗盤中，接種前營養(yǎng)土用自來水澆透，并放在配套的托盤上。9接種液的制備從冰柜中取出儲(chǔ)藏在-20℃下的一個(gè)油菜腫根(30g左右),置于室溫下1小時(shí)(h),將解凍軟化后的腫根放入粉碎攪拌機(jī)(型號(hào)JYL-C16D,功率250W)中，加入100ml的無菌去離子水(ddH?O)攪拌粉碎(轉(zhuǎn)數(shù)為18000～22000r/min),水質(zhì)參照GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法；待腫根充分粉碎后，獲取的腫根粉碎攪拌混合液用8層紗布過濾，得到根腫菌休眠孢子懸浮液在50g離心5min,收集上清液(含有休眠孢子),再從上清液中取樣1ml稀釋10倍，用醫(yī)用血球計(jì)數(shù)板檢查根腫菌休眠孢子數(shù)量并計(jì)算休眠孢子的濃度，然后在三角瓶標(biāo)簽上標(biāo)記注明休眠孢子懸浮液的濃度，并置入4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫蝗斯そ臃N前用ddH?O將休眠孢子懸浮液的濃度調(diào)配到所人工接種需要的接種濃度。10接種苗的準(zhǔn)備供接種用的油菜種子需先用75%(v/v)乙醇消毒30秒(s)后用無菌去離子水(ddH?O)震蕩漂洗3次，然后將消毒滅菌處理的種子置入發(fā)芽盒的發(fā)芽濾紙上催芽，發(fā)芽盒并在人工氣候箱中培養(yǎng)，設(shè)置氣候箱條件參數(shù)：溫度為24℃(光照)/18℃(黑暗),濕度為60%～80%,光周期為16h光照/8h流請(qǐng)勿傳播或其他用途11人工接種開始接種工作前提前半天將營養(yǎng)缽中裝有的滅菌處理過的營養(yǎng)基質(zhì)用自來水澆透，接種時(shí)將接種苗在接種濃度為1×10?個(gè)/ml的休眠孢子懸浮液中蘸根5s后栽入營養(yǎng)缽中，每營養(yǎng)缽中栽入1棵接種苗，每個(gè)重復(fù)接種苗25棵，設(shè)4次重復(fù)，移栽完畢后用滴管吸取接種濃度為1×10?個(gè)/ml的休眠孢子懸浮液1ml接種于幼苗根部土壤，接種實(shí)驗(yàn)設(shè)感病對(duì)照和抗病對(duì)照。油菜幼苗接種后使用酸水(pH6.0,用濃鹽酸配置)澆入托盤中，并將接種苗移入人工氣候溫室中；油菜幼苗接種后6w調(diào)查植株發(fā)病情況。12環(huán)境條件的控制4DB34/T2785—2016人工接種鑒定試驗(yàn)接種后的苗移入溫室中，接種苗需要在人工氣候溫室中培養(yǎng)6w,溫室的控制參數(shù)設(shè)置：溫度為24℃(光照)/18℃(黑暗),濕度為75%～85%,光周期為16h光照/8h黑暗，光照強(qiáng)度為15000～20000Lux。油菜幼苗接種后2w內(nèi)每隔1天(d)在托盤中澆入酸水(pH6.0,用濃鹽酸調(diào)制),并保持育苗營養(yǎng)缽中的基質(zhì)土水分充足，油菜幼苗接種2w以后根據(jù)苗情補(bǔ)充水分。13數(shù)據(jù)采集與結(jié)果判定接種后6w調(diào)查病害發(fā)病，以油菜根腫病為害癥狀病害分級(jí)(0-3級(jí))計(jì)算病情指數(shù)(diseaseindex,縮寫為DI),計(jì)算公式(1)如下。DI——病情指數(shù)；病級(jí)數(shù)(0～n);Xi——病情為i級(jí)的植株數(shù)量；Si——病情為i級(jí)的病級(jí)代表值；Sn—病情為最高病級(jí)代表值?！?<高抗HR≤5;——10<中抗MR≤20;見附錄B。14菌株保存與處理分離鑒定的菌株應(yīng)妥善保存，孢子懸浮液可置于4℃冰箱中臨時(shí)保存，病原菌株用感病品種Westar擴(kuò)繁后于零下20℃冰柜中長(zhǎng)期保存，每間隔5年(y)用感病品神Westar1促期繁殖。參照SN/T2632對(duì)于不需長(zhǎng)期保存的菌株應(yīng)及時(shí)采用高壓濕熱滅菌法滅活處理，參照GB15981標(biāo)準(zhǔn)。15結(jié)果記錄與資料保存完整的實(shí)驗(yàn)記錄包括樣品的來源、種類、時(shí)間，測(cè)試的時(shí)間、地點(diǎn)、方法和結(jié)果，實(shí)驗(yàn)人員和審核人員簽字。見附錄C。5(規(guī)范性附錄)根部沒有附著根腫。1級(jí)根部有細(xì)小腫瘤，根腫只附著在側(cè)根上，數(shù)量占根系全部的1-25%。2級(jí)根部有中等腫瘤，主根上有根腫附著，側(cè)根上根腫數(shù)量占根系全部25%以上。根部有異常大腫瘤，主根上有根腫附著，根腫數(shù)量占50%以上的根系。6(規(guī)范性附錄)油菜根腫病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表B.1油菜根腫病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)病情指數(shù)的數(shù)值范圍免疫Immune(I)5≥病情指數(shù)>0高抗HighlyResistant(HR)10≥病情指數(shù)>5抗病Resistant(R)20≥病情指數(shù)>10中抗ModeratelyResi