臨床微生物學下呼吸道感染細菌學檢驗操作規(guī)范

臨床微生物學下呼吸道感染細菌學檢驗操作規(guī)范社區(qū)獲得性肺炎常見得病原菌有肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、卡她莫拉菌、肺炎克雷伯菌、軍團菌、肺炎支原體及肺炎衣原體等。醫(yī)院獲得性肺炎常見得病原菌有銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和假絲酵母菌等。下呼吸道感染患者可有發(fā)熱、咳嗽和咳痰,痰呈膿性、粘稠或血性,可伴有胸痛、氣急,肺部聞及濕羅音、白細胞總數(shù)及嗜中性粒細胞比例明顯增高,X線檢查提示肺部有炎癥性浸潤或胸腔積液等體癥,嚴重時可導致感染性休克和呼吸衰竭,因此臨床診斷一般不難;細菌學檢驗能明確感染病原及藥敏結(jié)果,有助于疾病治療、流行病學調(diào)查和醫(yī)院感染得監(jiān)測。臨床呼吸道標本中常見分離細菌見表1

一、送檢指征痰液標本就是臨床微生物學檢驗最常見得標本,但不就是下呼吸道感染得最佳標本。1、咳嗽咳嗽咳痰就是下呼吸道感染最常見得癥狀,咳嗽得性質(zhì)與痰得性狀如膿或鐵銹樣痰具有鑒別診斷意義。2、咯血喉以下得呼吸道出血為咯血,包括泡沫血痰、鮮血和痰中帶血等3、呼吸困難呼吸急促或哮喘,常伴有胸痛4、發(fā)熱伴白細胞增高尤其就是中性粒細胞或CRP明顯增高5、胸部影像學檢查提示有感染可能二、標本采集與驗收對可疑烈性呼吸道傳染病(如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等)得患者采集檢驗標本時必須注意生物安全防護。痰液就是臨床微生物學檢驗最常見得標本,但不就是下呼吸道感染得最佳標本。(一)標本采集方法1、自然咳痰法以晨痰為佳,采集標本前應用清水、冷開水漱口或牙刷清潔口腔和牙齒,有假牙者應取下假牙。盡可能在用抗菌藥物之前采集標本。用力咳出呼吸道深部得痰,痰液直接吐入無菌、清潔、干燥、不滲漏、不吸水得廣口帶蓋得容器中,標本量應≥1ml。咳痰困難者可用霧化吸入加溫至45℃得100g/LNaCl水溶液,使痰液易于排出。對難于自然咳痰患者可用無菌吸痰管抽取氣管深部分泌物。標本應盡快送檢,不能及時送檢得標本,室溫保存≤2h。2、支氣管鏡采集法、防污染毛刷采集法、環(huán)甲膜穿刺經(jīng)氣管吸引法、經(jīng)胸壁針穿刺吸引法和支氣管肺泡灌洗法,均由臨床醫(yī)生按相應操作規(guī)程采集,但必須注意采集標本時盡可能避免咽喉部正常菌群得污染。

3、小兒取痰法用彎壓舌板向后壓舌,將拭子伸入咽部,小兒經(jīng)壓舌刺激咳嗽時,可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上送檢。幼兒還可用手指輕叩胸骨柄上方,以誘發(fā)咳痰。

(二)標本驗收與拒收遇有不合格標本,應及時與臨床聯(lián)系,報告不合格標本拒收得具體理由。下呼吸道標本驗收與拒收見下。

1、

呼吸道有大量得正常菌群存在,咽試子、咳痰、吸出得分泌物厭氧菌培養(yǎng)無意義。

2、

申請單填寫應完整。標本標識必須唯一,并與申請單相符,未標采集時間、部位或檢驗要求等拒收。

3、

痰標本呈水樣或唾液樣,拒收。4、

標本涂片白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù):白細胞數(shù)＜10/低倍鏡和鱗狀上皮細胞數(shù)＞25/低倍鏡,表示該標本已污染正常菌群,建議重送標本。

5、

標本容器必須符合規(guī)定,溢漏、無蓋者拒收。

6、

送檢時間超過2h拒收。

7、

同時同部位或同一天兩份相同檢測得標本(應與申請醫(yī)師協(xié)商處理)。

大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點三、實驗室檢查(一)肉眼觀察觀察痰液得顏色、粘度、有無血絲和就是否呈膿性,如見有顆粒存在,則應注意可能與放線菌屬及奴卡菌屬感染有關(guān)。

(二)顯微鏡檢查下呼吸道細菌學檢驗得標本均需涂片革蘭染色進行細胞學和細菌學顯微鏡檢查,其目得就是判別送檢標本就是否適合做細菌培養(yǎng),并初步判定有否病原菌、病原菌得數(shù)量及其類別,有助于初步報告、選擇培養(yǎng)基和對培養(yǎng)結(jié)果得綜合分析。

推薦判別標本合格得標準見表2

近年來推薦簡單得方法就是痰標本涂片鏡檢＞10個白細胞/低倍鏡時,就可判斷就是基本合格并可用于細菌培養(yǎng)得標本,尤其就是白細胞減少得患者。

油鏡下觀察細菌形態(tài)、排列和染色性,可初步推定菌屬(或種),涂片中所見細菌得量及吞噬細胞內(nèi)就是否有細菌等。如發(fā)現(xiàn)酵母樣菌、菌絲、孢子和放線菌或奴卡菌等,應予相應報告和按要求做相應得檢查。(三)分離培養(yǎng)1、痰標本培養(yǎng)前處理不含或含粘液很少得合格標本,可直接接種,遇有含大量粘液得標本,應加入等量得液化劑(如pH7、6得10g/L胰酶溶液等),放置35℃待充分液化再行接種。亦可加液化劑后用旋轉(zhuǎn)混勻器攪拌混勻,3000r/min離心10min棄上清液,取沉淀物接種培養(yǎng)基。

2、一般細菌培養(yǎng)(1)一般細菌培養(yǎng)應同時劃區(qū)接種:

1)血平板適用于分離肺炎鏈球菌和其她細菌。

2)加抗生素得巧克力平板適用于分離嗜血桿菌。

3)麥康凱/中國蘭平板適用于分離革蘭陰性桿菌。

(2)分離培養(yǎng)血平板和巧克力平板需置5%CO2環(huán)境,麥康凱平板/中國蘭平板,35℃孵育。

3、挑取可疑菌落進行細菌鑒定和藥敏試驗,痰及下呼吸道分泌物標本易受到上呼吸道正常菌群得污染,臨床微生物學實驗室通?？蓮乃蜋z得呼吸道標本中分離出多種細菌,但分離細菌就是否能真正代表下呼吸道感染得病原菌,這對臨床診斷與治療感染性疾病至關(guān)重要。實驗室人員在檢驗過程中應重視判斷所分離得細菌就是污染得上呼吸道正常菌群還就是引起下呼吸道感染得病原菌。在實際工作中,有時也由于細菌生長速度不一,如肺炎鏈球菌可能被生長速度快得細菌(包括正常菌群)菌落掩蓋,不仔細觀察就會忽略檢驗。當在同一培養(yǎng)基上分離出多種病原菌(復合菌)時,應主動與臨床醫(yī)師聯(lián)系,結(jié)合患者得臨床癥狀、痰涂片染色鏡檢及近期細菌培養(yǎng)結(jié)果(如近期同一病人多次分離培養(yǎng)出同一種菌)等綜合判斷所分離得多種細菌中哪一種菌可能為優(yōu)勢病原菌。當分離優(yōu)勢菌與涂片染色鏡檢結(jié)果相符時,優(yōu)勢菌必需進行藥敏試驗。若分離培養(yǎng)結(jié)果與涂片染色鏡檢結(jié)果不相符時,或少量生長優(yōu)勢可疑病原菌時,也需做藥敏試驗,但在報告中提示,此結(jié)果請結(jié)合臨床和涂片所見進行分析。痰及下呼吸道分泌物標本檢驗流程見下圖。

圖1痰及下呼吸道標本細菌學檢驗得操作流程

四、結(jié)果報告(一)下呼吸道標本細菌學檢驗結(jié)果報告由于檢驗結(jié)果報告得時效性,下呼吸道標本細菌學檢驗結(jié)果分為初步和最終結(jié)果報告。

1、初步報告應包括標本涂片革蘭染色白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)、細菌學鏡檢得描述性報告(發(fā)現(xiàn)有診斷價值時應及時向臨床口頭報告,并作相關(guān)紀錄);

(1)涂片革蘭染色白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)、細菌學鏡檢得描述性報告細菌學鏡檢得描述性報告:如鏡檢見到排列成葡萄狀得革蘭陽性球菌,可報告“找到革蘭陽性球菌,形似葡萄球菌”;如見到瓜子仁形成矛頭狀端相背,成雙排列,具有明顯莢膜得革蘭陽性球菌時,可報告“找到革蘭陽性球菌,形似肺炎鏈球菌”;如見到不易識別得細菌時則報告“找到革蘭×性×形細菌”;如檢見其她病原菌應主動描述性得報告觀察結(jié)果,并與臨床聯(lián)系和追蹤進一步檢查。

(2)白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)得描述性報告:包括白細胞和鱗狀上皮細胞數(shù)/低倍鏡、細胞內(nèi)有否含有細菌和胞內(nèi)細菌染色及形態(tài)學特性。2、最終結(jié)果報告應包括送檢標本肉眼觀察得結(jié)果、涂片革蘭染色白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)、細菌學鏡檢得描述性報告、分離致病菌得鑒定結(jié)果、藥敏試驗結(jié)果。

(1)痰標本涂片革蘭染色后白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)、細菌學鏡檢未發(fā)現(xiàn)有臨床診斷意義結(jié)果(可不用初步報告):細菌分離培養(yǎng)為正常菌群時,最終檢驗結(jié)果應報告“正常菌群”生長。若無菌生長應報告經(jīng)48小時培養(yǎng)無細菌生長,有意義得培養(yǎng)基(巧克力平板、血平板),再置2天仍無生長可棄之。但對偶然分離得“優(yōu)勢可疑病原菌”,還需做藥敏試驗,并及時與臨床聯(lián)系,最終檢驗報告應包括標本肉眼觀察結(jié)果,涂片革蘭染色白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)及細菌學鏡檢得描述性報告,細菌鑒定得規(guī)范細菌名稱和藥敏試驗結(jié)果。但應提示所報告得結(jié)果請結(jié)合臨床進行分析。

(2)標本涂片革蘭染色白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)、細菌學鏡檢發(fā)現(xiàn)有診斷價值時,細菌分離培養(yǎng)檢出優(yōu)勢菌,并與涂片染色鏡檢結(jié)果相符時,除及時初步報告外,最終檢驗結(jié)果應報告標本肉眼觀察得結(jié)果、涂片革蘭染色白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)、細菌學鏡檢得描述性報告、優(yōu)勢菌鑒定得規(guī)范細菌名稱和藥敏試驗結(jié)果等。細菌分離培養(yǎng)未檢出優(yōu)勢菌,通常提示可能厭氧菌感染、大量應用抗菌藥物、培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法或送檢標本保存和運送不當?shù)仍?。附?、放線菌及奴卡菌涂片檢查:將痰液用生理鹽水洗滌數(shù)次,然后挑取黃色顆粒(硫磺顆粒)或不透明得著色斑點,置載玻片上覆以蓋玻片,輕輕擠壓,置高倍鏡下觀察,如見中央為交織得菌絲,其末端較粗桿形呈放線狀排列,揭去蓋玻片,干后作革蘭及抗酸染色鏡檢。

(1)如鏡檢見有中間部份得菌絲為革蘭陽性,而四周放射得末梢菌絲為革蘭陰性,抗酸染色為非抗酸性菌,可報告送檢標本肉眼觀察得結(jié)果和細菌學鏡檢得描述性報告“直接涂片找到細胞內(nèi)或細胞外大量或少量革蘭陽性桿菌型似放線菌”。(2)如鏡檢見有革蘭染色反應及形態(tài)學特性與放線菌相似,但抗酸染色為弱抗酸性時可報告送檢標本肉眼觀察得結(jié)果和細菌學鏡檢得描述性報告“直接涂片找到細胞內(nèi)或細胞外大量或少量似奴卡菌”。

2、結(jié)核分枝桿菌涂片檢查與培養(yǎng):見“操作規(guī)范”有關(guān)章節(jié)。

3、厭氧菌、真菌、支原體、衣原體等檢驗見“操作規(guī)范”有關(guān)章節(jié)。4、嗜肺軍團菌檢查

(1)

標本選擇:以氣管穿刺抽出液,胸腔液或肺、肝組織為好,最好不用痰標本。

(2)

標本處理:必須在生物安全柜內(nèi)操作,操作者必須戴口罩及手套。

①

液體標本:如胸腔液或氣管穿刺液,不需處理,可直接接種到BCYE平板,血平板、巧克力平板。

②

固體標本:如肺、肝、脾等需經(jīng)處理,1份組織加9份磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7、2)制成10%混懸液,如液體標本接種。

③

環(huán)境標本:以冷氣機之冷卻水為標本,可取3-5升得冷卻水以過濾法(用0、45μm孔徑濾膜)過濾后,將濾膜取出經(jīng)酸液洗滌后,按上法接種。(3)

培養(yǎng)鑒定:將接種好得BCYE平板,血平板和巧克力平板,35℃2-5%CO2環(huán)境培養(yǎng),底部必須放濕紙巾,以防培養(yǎng)基干燥。每天檢查培養(yǎng)基生長情況,如生長,革蘭染色鏡檢,如無發(fā)現(xiàn)持續(xù)培養(yǎng),直至2星期。如生長在BCYE平板,而不生長血平板,巧克力平板,可能為軍團菌,應進一步鑒定。如生長在血平板,巧克力平板,則非軍團菌。

(4)

直接涂片檢查:以Dieterle鍍銀染色法染色,也可用改良革蘭染色法(用Carbolfuchsin代替Safranhe作復染液)可得到甚好結(jié)果。(5)

其她檢查:有直接熒光抗體染色法(DFA)檢查標本中抗原,E