實驗四血清γ球蛋白的提純

實驗四血清γ球蛋白的提純請同學們清洗自己小組以下用品每個小組:層析柱(1支)比色板(2塊)玻璃棒(1支)離心管(1支)滴管(2支)燒杯(2個)試管(13支)注意實驗過程中每用一次清洗一次！問題1、血清蛋白質(zhì)得分類？

清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白2、分離純化蛋白質(zhì)得方法？

電泳、透析及超濾、有機溶劑沉淀、鹽析、免疫沉淀、層析、超速離心法等3、鹽析？層析？透析？

加入中性鹽破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素而使其沉淀(水化膜和電荷層)利用各組分理化性質(zhì)不同而分離(本實驗就是利用組分分子大小不同而分離)半透膜把大小分子分開4、本實驗鹽析所用硫酸銨飽和度就是多少？

33%5、定性檢測蛋白質(zhì)和銨根離子得方法？

縮二脲反應(yīng)(紫紅色)或者與磺柳酸反應(yīng)生成白色沉淀納氏試劑(黃色或棕色)一、實驗目得

1、掌握蛋白質(zhì)分離純化方法;2、掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質(zhì)得基本原理;3、熟悉離心機得操作;4、熟悉蛋白質(zhì)、NH4+定性檢測得方法。分離純化蛋白質(zhì)得方法沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電學法電泳法等電聚焦離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析離心膜分離技術(shù)透析超濾二、實驗原理

本實驗就是應(yīng)用相同濃度得硫酸銨反復鹽析分離血清中得γ-球蛋白,再利用凝膠層析法除鹽,即可得到比較純得γ-球蛋白。

采用鹽析法分離清蛋白(主要就是清蛋白),再用透析方法除去小分子物質(zhì)。二、實驗原理(一)鹽析(salting-out)定義:加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)得穩(wěn)定因素并使其從溶液中沉淀析出得現(xiàn)象。原理:破壞蛋白質(zhì)兩個穩(wěn)定因素:水化膜和電荷層中性鹽:(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點:蛋白質(zhì)不變性,常用方法。二、實驗原理(二)透析(dialysis)定義:利用半透膜把大小分子分開。透析法就是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜,而大分子物質(zhì)不能通過半透膜得性質(zhì),達到分離得方法。其利用半透膜原理,通過擴散、對流體內(nèi)各種有害以及多余得代謝廢物和過多得電解質(zhì)移出體外,達到凈化血液得目得,并且達到糾正水電解質(zhì)及酸堿平衡得目得。臨床應(yīng)用:血液透析二、實驗原理(三)層析(chromatography)

層析技術(shù)就是利用混合物中各組分物理化學性質(zhì)(如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等)得差別,使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域,借此將各組分分離。

按層析得原理不同可以分為:吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析。(教程P25)

凝膠就是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得物質(zhì)(分子大小不同)

小分子進入凝膠顆粒得微孔中,流程長,下移速度慢;大分子不能進入凝膠顆粒得微孔中去,只能分布在顆粒得間隙中,所以流程短,向下移動速度快。二、實驗原理凝膠層析法(根據(jù)分子大小差異而分離)二、實驗原理(四)離心(centrifuge)

離心技術(shù)就是利用離心力,依據(jù)物質(zhì)得沉降系數(shù)、擴散系數(shù)和浮力密度差異而進行物質(zhì)得分離、濃縮和分析得一種技術(shù)。二、實驗原理離心操作要領(lǐng)1、根據(jù)待離心得溶液性質(zhì)及體積選擇合適得離心管。裝載液體時要按各種離心機操作說明進行。無蓋離心管不能裝得太滿。密封得或有蓋離心管常要求裝滿,以免離心管變形。2、檢查離心管套筒就是否完好、套筒內(nèi)有沒有軟膠墊或棉花。3、精確地平衡離心管及其內(nèi)容物(配平)。4、平衡后得離心管和內(nèi)容物(包括套筒)應(yīng)對稱放置。5、啟動離心時離心速度由慢到快。大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜二、實驗原理(五)檢測蛋白質(zhì)、NH4+得方法①檢測蛋白質(zhì)縮二脲試劑:溶液顯紫紅色20％磺柳酸:有白色沉淀產(chǎn)生②檢測NH4+納氏試劑:黃色或棕色三、實驗操作1、鹽析2、透析3、層析(脫鹽)4、檢測1、鹽析取離心管一支加入血清2ml加入2mlPBS,搖勻逐滴加入pH7、2飽和(NH4)2SO4

2ml,搖勻上清液(主要含清蛋白)傾入試管中靜置10分鐘,再離心(2000轉(zhuǎn)/分)10分鐘沉淀用1mlPBS攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO4

0、5ml,搖勻傾棄上清液(主要含α、β球蛋白)沉淀即為初步純化得γ－球蛋白透析脫鹽靜置10分鐘,再離心(2000轉(zhuǎn)/分)10分鐘用于配平用于配平樣品為豬血清2、透析清蛋白

換水①透析袋剛放入水中時,立即取袋外液體檢查有無NH4＋;②每隔4分鐘檢查一次,共3次,比較NH4＋透出得情況。①約0、5小時,檢查袋外液體得NH4＋情況;②取袋外液2滴,置于小試管中,然后滴加20％磺柳酸1~2滴,觀察有無沉淀產(chǎn)生。水

水

3、層析

12345678910②上樣γ－球蛋白,PBS10滴溶解①裝柱

裝柱前用濾紙片堵住層析柱下口,防止下端玻紗堵塞葡聚糖凝膠G－25,柱高3/4~2/3柱長流速:每分鐘10滴左右

③加入洗脫劑PBS10ml④收集20滴換一支試管⑤

層析后洗脫液檢測每組兩塊比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加納氏試劑(檢測NH4+),另一塊滴加縮二脲試劑(檢測蛋白質(zhì))。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應(yīng)此孔顯色劑棄用。檢測蛋白及銨根離子不用滴管,避免污染,直接用試管傾倒。用“-”表示無現(xiàn)象,用“+”,“++”,“+++”等表示顏色深淺。⑥

回收凝膠四、實驗結(jié)果(用+-號表示,不寫顏色)表1、層析后洗脫液得顯色結(jié)果表2、透析后得袋外溶液顯色結(jié)果試管編號12345678910縮二脲試劑檢測后現(xiàn)象納氏試劑檢測后現(xiàn)象檢測次數(shù)123456試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑20%磺柳酸現(xiàn)象檢測人:時間:檢測人:時間:五、注意事項１、正確使用離心機。２、裝柱時檢查層析柱下端就是否有濾紙片,就是否漏水。３、裝柱后凝膠均一、無斷層,無氣泡,柱床面平整。４、柱床面保持有緩沖液。５、層析加樣時動作緩慢輕柔,不要破壞柱床面得平整。６、每用一次滴管,請用水清洗干凈,防止試劑及被測樣品交叉污染。7、兩人一組,分工協(xié)作。思考1、為什么硫酸銨能夠使蛋白質(zhì)沉淀？2、本實驗鹽析所用鹽得飽和度就是多少？為什么能夠沉淀γ-球蛋白？3、如何證明分離純化得樣品就是何種蛋白質(zhì)？4、兩步鹽析之后,沉淀中含有哪些物質(zhì)？5、層析結(jié)果好壞得判斷標準就是什么？6、透析時,燒杯中出現(xiàn)蛋白質(zhì)說明什么問題？預習實驗五細胞核得分離與核酸得鑒定1、核酸得基本組成2、DNA和RNA結(jié)構(gòu)及分布區(qū)域3、核酸