生物質能源轉化原理與技術實驗指導書

《生物質能源轉化原理與技術》課堂實驗/實踐指導書課程中文名稱：生物質能源轉化原理與技術課程英文名稱：BiomassEnergyTransformationPrinciple課程編號：021060380適用專業(yè)：新能源科學與工程學時數(shù)：總課時32（理論課28+實驗4）學分數(shù)：2課程類別：專業(yè)課程應開課學期：第七學期實驗/實踐一：培養(yǎng)基的制備及厭氧菌群的培養(yǎng)實驗/實踐類型：演示實驗/實踐學時：2實驗/實踐要求：必做一、實驗/實踐目的掌握微生物實驗室常用玻璃器皿的清洗；掌握培養(yǎng)基的配置方法以及厭氧菌的培養(yǎng)方法；掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的操作方法；加深對理論知識的理解，培養(yǎng)動手和動腦相結合的實際操作能力。實驗/實踐內容1.根據(jù)要求清洗各種玻璃器皿；2.根據(jù)要求配制培養(yǎng)基，用高壓蒸汽滅菌鍋對所配各培養(yǎng)基滅菌；對礦井水中的厭氧菌群進行培養(yǎng)。三、實驗材料及儀器設備1.培養(yǎng)基配方1）產甲烷菌富集基：每1000mL礦井水中加入1.0gNH4Cl、0.1gMgCl2·6H2O、0.4gK2HPO4·3H2O、0.2gKH2PO4、0.2gNa2S、2.0gNaHCO3、0.001gC12H7NO4、0.5gC3H7NO2S、2.0gHCOONa、2.0gCH3COONa、1.0g酵母膏、0.1g胰蛋白胨和10mL微量元素液。

2）微量元素液：每1000mL無菌去離子水中加入氨基三乙酸1.5g、MnSO4·2H2O0.5g、MgSO4·7H2O3.0g、FeSO4·7H2O0.1g、NaCl1.0g、CoCl2·6H2O0.1g、CaCl2·2H2O0.1g、CuSO4·5H2O0.01g、ZnSO4·7H2O0.1g、H3BO30.01g、AlK(SO4)20.01g、NiCl2·6H2O0.02g、Na2MoO40.01g。2.儀器設備恒溫培養(yǎng)箱，往復式恒溫搖床，pH計，血清瓶及配套設備，市售醫(yī)用一次性無菌注射器。四、實驗/實踐原理、方法、手段和步驟一、實驗原理：在培養(yǎng)厭氧微生物時，需要消除環(huán)境中的氧氣并降低培養(yǎng)基的氧化還原勢。消除氧氣的方法有物理、化學和生物方法，或它們的綜合使用。簡單地介紹如下：(1).通無氧氣體。向厭氧微生物培養(yǎng)的小環(huán)境和培養(yǎng)基中通入無氧氣體，如高純氮氣和二氧化碳，即可基本驅除其中的氧氣。(2).添加還原劑。向培養(yǎng)厭氧微生物的培養(yǎng)基中添加還原劑，如半胱氨酸和硫化鈉，可消除其中的氧，降低培養(yǎng)基的氧化還原勢。(3).堿性焦性沒食子酸法。焦性沒食子酸與堿溶液作用后形成易被氧化的堿性沒食子鹽，能通過氧化作用而形成黑、褐色的焦性沒食子橙，從而除掉密封容器中的氧。該法操作簡單，無需特殊和昂貴的設備，但其除氧速度較慢。對于一些厭氧要求較高的微生物，如產甲烷菌，單一的除氧方法無法達到其生長所需的厭氧程度，常需結合兩種除氧方法。如對培養(yǎng)基進行除氧，制作預還原培養(yǎng)基時，常先向培養(yǎng)基中通高純氮氣，先去除培養(yǎng)基中的絕大部分的氧后，再往培養(yǎng)基中添加適量的還原劑，即可制成高度無氧的預還原培養(yǎng)基。二、實驗步驟1.玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2.液體培養(yǎng)基的配制過程稱量：一般可用0.01g天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品，先按培養(yǎng)基配方計算出各成分的用量．然后進行準確稱量。溶解：將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實驗需要可用自來水或蒸餾水)，用玻璃棒攪動，加熱溶解。定容：待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時，可預先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中。調pH：一般用pH試紙測定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時，可用1mol/LNaoH或1mol/LHCl溶液進行調節(jié)。調節(jié)pH時，應逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試，直至達到所需pH為止。過濾：用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基。一般無特殊要求時，此步可省去。3.培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基經分裝包扎后，應立即按配制方法規(guī)定的滅菌條件進行進行高壓蒸汽滅菌。滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進行無菌檢查。最好取出1~2管(瓶)，置于37℃溫箱中培養(yǎng)1~2天，確定無菌后方可使用。4.無菌水的制備在每個250mL的三角瓶內裝100mL的蒸餾水并塞上棉塞或硅膠塞。在每支試管內裝4.5mL蒸餾水，塞上棉塞或硅膠塞。再在棉塞上包上一張牛皮紙，高壓蒸汽滅菌。0.1MPa滅菌20~30min。5.厭氧菌培養(yǎng)將配制好的產甲烷菌富集培養(yǎng)基，裝入到121℃滅菌后的錐形瓶中，充氮氣2min后迅速密封，然后放置到恒溫培養(yǎng)箱中，在35℃條件下厭氧發(fā)酵4d，得到產甲烷菌群的富集溶液。五、實驗/實踐結果處理對比三角瓶中菌體的生長以及產氣情況（條件允許可拍照）并予以分析。六、實驗/實踐注意事項1．實驗一般不允許學生請假，確因特殊情況需要請假，須事先經指導教師和主管教學院長批準；2．實驗期間，不得遲到、早退，有事必須向指導教師請假，不得擅自離隊。必須服從指揮、注意聽講、認真參觀、多加思考、記好筆記；3．嚴格遵守組織紀律，禁止進入受限空間，遵守紀律，注意安全，未經實驗室老師的許可，不得亂動任何設備。4．滅菌過程中，達到滅菌所需的時間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當壓力表的壓力降至“0”后，方可打開排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內剩水。壓力一定要降到“0”后，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養(yǎng)基或試劑由于內外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。七、預習與思考題簡述配制培養(yǎng)基的基本步驟及注意事項。配制培養(yǎng)基時為什么要調節(jié)pH？高壓蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌要求溫度低、時間短？厭氧培養(yǎng)的基本原理以及注意事項。實驗/實踐二：厭氧發(fā)酵液液相成分檢測實驗/實踐類型：演示實驗/實踐學時：2實驗/實踐要求：必做一、實驗/實踐目的1．熟悉厭氧發(fā)酵過程中液相成分的組成及含量，認識并使用測試儀器和主要器皿；2．掌握各種儀器性能及使用方法，熟悉各種液相成分測定的操作方法；3．加深對理論知識的理解，培養(yǎng)動手和動腦相結合的實際操作能力。二、實驗/實踐內容1．了解并認識發(fā)酵液液相成分所需儀器設備，熟悉液相成分測試流程以及操作過程中的規(guī)章和規(guī)定；2．了解并認識氣相色譜-質譜聯(lián)用儀的基本結構、工作原理，熟悉儀器操作流程以及操作過程中的規(guī)章和規(guī)定；三、儀器設備揮發(fā)性脂肪酸標準品、離心機、氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、萃取儀、容量瓶、內標液、乙酸乙酯四、實驗/實踐原理、方法、手段和步驟一、實驗原理：氣相色譜-質譜聯(lián)用儀是一種質譜儀，氣相色譜的流動相為惰性氣體，氣-固色譜法中以表面積大且具有一定活性的吸附劑作為固定相。當多組分的混合樣品進入色譜柱后，由于吸附劑對每個組分的吸附力不同，經過一定時間后，各組分在色譜柱中的運行速度也就不同。吸附力弱的組分容易被解吸下來，最先離開色譜柱進入檢測器，而吸附力最強的組分最不容易被解吸下來，因此最后離開色譜柱。如此，各組分得以在色譜柱中彼此分離，順序進入檢測器中被檢測、記錄下來。質譜分析是一種測量離子荷質比（電荷-質量比）的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質比的帶正電荷的離子，經加速電場的作用，形成離子束，進入質量分析器。在質量分析器中，再利用電場和磁場使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質譜圖，從而確定其質量。二、實驗步驟：1．標準溶液的配制根據(jù)需要配制合適濃度的標準工作液體待用。以揮發(fā)性脂肪酸為例：準確稱取各短鏈脂肪酸對照品，用無水乙醇溶解并定容，得到7種標準品的單儲備液，并加入50uLd4-乙酸內標溶液，根據(jù)需要配置系列工作溶液。2．樣品前處理取凍存的樣品，加1000μL乙酸乙酯溶液(含0.5%(V/V)濃HCl)，加入50uLd4-乙酸內標溶液，渦旋混勻，超聲40min萃取，然后14000r/min離心10min，取上清液直接進行氣相色譜質譜分析。3．儀器條件氣相色譜分析條件為毛細管柱采用DB-FFAP毛細管色譜柱[30m（長度）×0.25mm（內徑）×0.25m（膜厚）]，載氣為氦氣，載氣流速為1.0mL/min；進樣口溫度：250℃，不分流。升溫程序：初始溫度50℃保持2min，以15℃/min升至120℃，以5℃/min升至170℃，以15℃/min升至240℃后保持3min。MS條件：電子轟擊電離（EI）源，全掃及SIM掃描方式，電子能量70eV。五、實驗/實踐結果處理將混合標準品溶液逐級稀釋成系列標準品溶液，以標準品濃度比上內標濃度x(μg/mL)為橫坐標，以對照品的峰面積比上內標峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線，計算樣品中目標物含量。六、實驗/實踐注意事項1．實驗一般不允許學生請假，確因特殊情況需要請假，須事先經指導教師和主管教學院長批準；2．實驗期間，不得遲到、早退，有事必須向指導教師請假，不得擅自離隊。必須服從指揮、注意聽講、認真參觀、多加思考、記好筆記；3．嚴格遵守組織紀律，禁止進入受限空間，遵守紀律，注意安全，未