TSATA 071-2024 水中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的測定熒光檢測法

ICS13.060.01Determinationoftotalcoliform,EscherichiacoliandfecalcoliforminwaterIT/SATA071—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4方法原理 5試劑與材料 6儀器和設備 27樣品 27.1樣品的采集 27.2樣品的保存 27.3試樣的制備 27.4空白試樣的制備 28分析步驟 38.1試樣測定 38.2空白試驗 38.3陽性和陰性對照試驗 39結果計算與表示 39.1定量分析 39.2結果表示 310質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 310.1空白試驗 310.2平行樣的測定 410.3質(zhì)控樣品的測定 410.4培養(yǎng)基的質(zhì)量檢驗 410.5菌株保存 411廢物處理 4T/SATA071—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本標準可能涉及某些有危險性的材料、操作和設備，但是并未對與此有關的所有安全問題都提出建議。因此，使用者在應用本標準前應建立適當?shù)陌踩头雷o措施，并確定相關規(guī)章限制的適用性。本文件由深圳市分析測試協(xié)會提出并歸口。本文件起草單位：廣東粵海水務檢測技術有限公司、廣東粵海水務股份有限公司。本文件主要起草人：路曉鋒、楊穎、彭俊翔、游文丹、郭瞻宇、王樊、黃俊能、吳凡、黃子其、陸心卉、韋雪檸、陳桂暢、戴歡、吳金鑫、黃慧星、龍慶平、馮國仁、王慶生、何振乾、文金麗、鄭開云、楊創(chuàng)濤、彭鷺、李秀虹、陳誠、吳國秋、曾惠、盧鵬澄、潘明茗、甘林林。1T/SATA071—2024水中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的測定熒光檢測法本文件提供了測定水中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的熒光檢測法。本文件適用于地表水中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法HJ91.2-2022地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測技術規(guī)范GB/T14581水質(zhì)湖泊和水庫采樣技術指導HJ494水質(zhì)采樣技術指導3術語和定義HJ1001-2018界定的術語和定義適用于本文件。3.1總大腸菌群totalcoliforms在37℃培養(yǎng)能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌。[來源：HJ1001-2018，3.1]3.2大腸埃希氏菌escherichiacoli俗稱大腸桿菌，在37℃培養(yǎng)能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成黃色的鄰硝基苯酚，同時產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶，分解選擇性培養(yǎng)基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷釋放出熒光物質(zhì)的腸桿菌科細菌。[來源：HJ1001-2018，3.3]3.3糞大腸菌群fecalcoliforms又稱耐熱大腸菌群（thermotolerantcoliforms）。在44.5℃培養(yǎng)能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌。[來源：HJ1001-2018，3.2]4方法原理使用試劑盒進行總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的檢測，利用試劑盒中酶底物培養(yǎng)基，一定量的水樣與培養(yǎng)基混合均勻放置于適宜溫度下（總大腸菌群和大腸埃希氏菌37℃±1℃、糞大腸菌群44.5℃±0.5℃)環(huán)境下，當細菌生長時，可利用乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)生特定的酶，并水解不同的底物生成熒光物質(zhì),依據(jù)待測水樣熒光強度變化與水中的總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群數(shù)成一定關系的原理，從而得出總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群濃度。5試劑與材料2T/SATA071—2024除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純試劑，實驗用水為符合GB/T6682標準的一級5.1硫代硫酸鈉（Na2S2O3?5H2O）。5.2乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2?2H2O）。5.3硫代硫酸鈉溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10g/mL。稱取15.7g硫代硫酸鈉（5.1），溶于適量水中，定容至100mL，臨用現(xiàn)配。5.4乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ（C10H14N2O8Na2?2H2O）=0.15g/mL。稱取15.0g乙二胺四乙酸二鈉（5.2溶于適量水中，定容至100mL，此溶液保質(zhì)期為30d。5.5無菌水：取適量實驗用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。5.6試劑盒：包括用于檢測糞大腸菌群的試劑盒和用于檢測總大腸菌群、大腸埃希氏菌的試劑盒。6儀器和設備6.1全自動微生物檢測系統(tǒng)。6.2采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的100mL、250mL、500mL廣口玻璃瓶。6.3高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。6.4量筒：100mL±1mL。6.5移液管：1mL±0.01mL、10mL±0.1mL。也可采用計量合格的可調(diào)式移液器。6.6三角瓶：100mL。6.7天平：感量0.01g。注1：在采集不存在或不考慮余氯、金屬離子干擾的樣品時，可采用市售7樣品7.1樣品的采集采集河流、湖庫等地表水樣品時，可握住瓶子下部直接將帶塞的采樣瓶插入水中，約距水面10cm-15cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶內(nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無菌包裝紙。也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點進行分層采樣時，應自上而下進行，以免不同層次的攪擾。如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（5.3），以除去活性氯對細菌的抑制作用（每125mL容積加入0.1mL的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（5.4以消除干擾（每125mL容積加入0.3mL的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。注：15.7mg硫代硫酸鈉（5.3）可去除樣品中1.5mg活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)樣品實際活性氯量調(diào)整。7.2樣品的保存采樣后應在2h內(nèi)檢測，否則，應10℃以下冷藏但不得超過6h。實驗室接樣后，不能立即開展檢測的，將樣品于4℃以下冷藏并在2h內(nèi)檢測。7.3試樣的制備對于較為潔凈的地表水，可直接取地表水樣品100mL進行檢測，如需對樣品進行稀釋，可采用10倍逐級稀釋法對樣品進行稀釋。7.4空白試樣的制備以滅菌水代替樣品，直接取100mL水樣進行檢測。3T/SATA071—20248分析步驟8.1試樣測定根據(jù)樣品污染程度確定接種量。通常接種量為100mL。當接種量小于100mL時，應稀釋樣品后接種，接種量為10mL時，取10mL樣品加入到盛有90mL無菌水（5.5）的三角瓶（6.6）中混勻制成1:10的稀釋樣品，其它接種量的稀釋樣品依次類推。將接種后的檢測套筒放置于全自動微生物檢測系統(tǒng)內(nèi)，糞大腸菌群設置FCA檢測模式，培養(yǎng)溫度為44.5℃,在2h～18h后儀器自動培養(yǎng)得出結果；總大腸菌群和大腸埃希氏菌設置CCA檢測模式，培養(yǎng)溫度為37℃,在2h～18h后儀器自動培養(yǎng)得出結果。8.2空白試驗按照與試樣測定（8.1）相同的操作步驟進行空白試樣（8.2）的測定。8.3陽性和陰性對照試驗將標準菌株制成300～3000個/mL的菌懸液，按照試驗測定（8.1）過程操作，陽性菌株應呈陽性反應，陰性菌株應呈陰性反應。否則，該次樣品測定結果無效。也可使用市售的已知濃度的定量菌株進行操作。總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的陽性、陰性菌株參考表1。表1陽性、陰性菌株參考表大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter假單胞菌屬(Pseudomonassp.)大腸埃希氏菌（耐熱型）、克雷伯氏菌屬9結果計算與表示9.1定量分析樣品中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群的濃度C按照公式（1）進行計算。式中：C——樣品中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群濃度，MPN/L；MPN——儀器的讀數(shù)值，即每100mL樣品中總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群濃度，MPN/100mL；1000——將C單位由MPN/mL轉換為MPN/L；f——最大接種量,mL。9.2結果表示測定結果保留兩位有效數(shù)字，當測定結果≥100MPN/L時，以科學計數(shù)法表示，若結果為陰性時，可報告為＜10MPN/L或未檢出。10質(zhì)量保證和質(zhì)量控制10.1空白試驗4T/SATA071—2024每批