DB61-T+1813-2024化妝品緊致功效測試技術(shù)規(guī)范

ICS71.100.70CCSY42

DB61陜 西 省 地 方 標 準DB61/T1813—2024化妝品緊致功效測試技術(shù)規(guī)范TechnicalSpecificationforcomesticsfirmingefficacytest20242024040320240503陜西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB61/T1813DB61/T1813—2024DB61/T1813DB61/T1813—2024目??次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1基本要求 2測試準備 3測試 4數(shù)據(jù)處理 5測試報告 5質(zhì)量保證 5II前??言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由陜西省藥品監(jiān)督管理局提出并歸口。本文件起草單位：陜西省食品藥品檢驗研究院、陜西博溪通用檢測科技有限公司、陜西省藥品和疫苗檢查中心、陜西省藥品技術(shù)審評中心、咸陽市食品藥品檢驗檢測中心。本文件主要起草人：王莉芳、蔡虎、曹涵博、楊文娟、盧永波、李瀟、劉海靜、吳小勇、馮潤東、黨琳琳、羅阿利、張若冰、李曉春。本文件首次發(fā)布。本文件由陜西省食品藥品檢驗研究院負責解釋。聯(lián)系信息如下：單位：陜西省食品藥品檢驗研究院電話編：710065II地址：陜西省西安市高新區(qū)科技五路21郵編：710065II化妝品緊致功效測試技術(shù)規(guī)范范圍本文件適用于化妝品體外成纖維細胞彈性蛋白含量測試。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T622 化學試劑鹽酸GB/T646 化學試劑氯化鉀GB/T678 化學試劑乙醇（無水乙醇）GB/T1266 GB/T1274 GB/T1266 GB/T1274 GB/T3102.6 光及有關(guān)電磁輻射的量和單位GB/T6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T21395 二甲基亞砜SN/T3899 3術(shù)語和定義SN/T3899界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1緊致firming有助于保持皮膚的緊實度，彈性。3.2紫外光輻照強度ultravioletlightirradiance（如（mW/cm2）。13.3紫外光輻照劑量ultravioletlightirradiationdose入射到某一表面的紫外線（如UVA）的量（強度×時間），單位為焦耳每平方米（J/m2）或焦耳每平方厘米（J/cm2）。3.4酶聯(lián)免疫吸附測定法enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA基本要求環(huán)境要求100級要求，環(huán)境溫度應(yīng)控制在20℃～24℃，環(huán)境濕度應(yīng)控制在50%～70%，防震動，防電磁干擾。其他試驗操作應(yīng)在常規(guī)實驗室環(huán)境下進行，生物安全等級達到一級要求。耗材和試劑所用試劑應(yīng)為分析純，試驗用水應(yīng)按GB/T6682的要求進行制備。與細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑、耗材應(yīng)作無菌處理。耗材耗材應(yīng)滿足下列要求：所用試劑應(yīng)為分析純，試驗用水應(yīng)按GB/T6682的要求進行制備。與細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑、耗材應(yīng)作無菌處理。耗材耗材應(yīng)滿足下列要求：25cm2、75cm2培養(yǎng)瓶；6孔平底細胞培養(yǎng)板；1.5mL、15mL、50mL；10μL、200μL、1000μL；0.22μm。試劑試劑應(yīng)滿足下列要求：Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium培養(yǎng)基（DMEM）；SN/T3899的要求；磷酸二氫鉀（KH2PO4）GB/T1274的要求；十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）GB/T1263的要求；氯化鈉（NaCl）GB/T1266的要求；氯化鉀（KCl）GB/T646的要求；鹽酸（HCl）GB/T622的要求；GB/T678的要求；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）粉末純度≥95%；2GB/T21395的要求；44pmL0.18nmL～12nmL。試劑配制試劑配制應(yīng)滿足以下要求：90mLDMEM10mL14d；（0.10.27g2.87g8.00g0.20g800mLpH7.41000mL，過14d；TGF-β1溶液（100ng/mL）0.002mgTGF-β11mL0.002mg/mL0.22μm28100ng/mLTGF-β1溶液；酶聯(lián)免疫吸附測定法相關(guān)試劑應(yīng)按照試劑盒說明書配制所需溶液。儀器設(shè)備儀器設(shè)備應(yīng)符合下列要求：37℃，5CO2，95%相對濕度；100級；0.0001g；超低溫冰箱溫度為-40℃～-86℃；100倍～400倍；200nm～999nm；UVA315nm～400nm；315nm～400nm；1000r/min～14000r/min4℃；0r/min～1000r/min；2μL～20μL、20μL～200μL、100μL～1000μL；5×104個細胞/mL～1×107個細胞/mL。測試準備細胞準備10DMEM細胞培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。P72×105個細胞/孔6324h±2h后用于試驗。樣品制備受試物的配制應(yīng)根據(jù)受試物理化特性選擇合適的溶劑配置成受試物工作液，配制要求如下：3（母液中受試物的濃度應(yīng)為試驗濃10倍～1000倍），過濾除菌，然后使用細胞培養(yǎng)液稀釋到試驗濃度；（母液中受試物的濃100倍～1000倍），過濾除菌，其中二甲基亞砜或無水乙醇的體積在溶液1%。受試物濃度的選擇應(yīng)通過細胞毒性試驗確定受試物安全濃度范圍，以受試物處理細胞后細胞活力≥90%時的濃度為安全濃度的最高濃度，在安全濃度范圍內(nèi)，選擇1個～3個濃度作為受試物試驗濃度。試驗分組試驗過程中應(yīng)按如下要求分組：UVA輻照；30J/cm2UVA輻照劑量輻照；30J/cm2UVA輻照劑量輻照。100ng/mLTGF-β1。30J/cm2UVA輻照劑量輻照。儀器準備UVAUVA輻照儀開關(guān)打開后應(yīng)穩(wěn)定15min±2minUVA輻照儀的輻照強度進行校準，確保UVA輻照儀輻照強度穩(wěn)定。6測試受試物孵育應(yīng)棄掉培養(yǎng)孔中的細胞培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，操作過程按照5.3要求進行，各試驗組細胞孵育時間宜為24h±2h。UVAUVA輻照過程應(yīng)在無菌操作環(huán)境下進行，清洗并更換細胞培養(yǎng)液為磷酸鹽緩沖溶液，每孔添加量為1mL。按照5.3試驗分組進行UVA輻照，輻照劑量宜為30J/cm2。照射時間計算見式（1）：tH/E (1)式中：t——照射時間，單位為秒（s）；H——輻照劑量，單位為毫焦每平方厘米（mJ/cm2）；E——輻照強度，單位為毫瓦特每平方厘米（mW/cm2）。換液UVA輻照結(jié)束后，應(yīng)將磷酸鹽緩沖液更換為新的培養(yǎng)液，各試驗組細胞孵育時間宜為24h±2h。細胞上清液收集及保存4孵育培養(yǎng)結(jié)束后，每孔應(yīng)收集不少1mL細胞培養(yǎng)液，用于檢測；如需儲存應(yīng)儲存于超低溫冰箱，有效期90d。6.5檢測應(yīng)對細胞培養(yǎng)液離心，離心轉(zhuǎn)速宜為12000r/min、時間不小于10min。離心后收集上清液，按照彈性蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒說明書所述方法進行稀釋及測定。數(shù)據(jù)處理彈性蛋白含量計算按照試劑盒說明書提供的計算方法計算，每組應(yīng)取3個復(fù)孔的平均值作為檢測結(jié)果，結(jié)果表示為平均值±標準差（Mean±SD）。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)應(yīng)使用t檢驗分析顯著性差異，雙尾檢驗。與陰性對照組相比，p<0.05則認為其具有統(tǒng)計學差異。精密度(SD/Mean)100% (2)式中：C.V(SD/Mean)100% (2)式中：C.V——變異系數(shù)；SD——標準差；Mean——平均值。8測試報告宜包括但不限于以下幾個方面的內(nèi)容：——目的；——材料；——設(shè)備；——受試物信息；——方法；——