DB34T4878-2024包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速檢測 膠體金免疫層析法

ICS13.160.20CCSICS13.160.20CCSX04安 徽 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB34/T4878—2024包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速檢測膠體金免疫層析法RapiddetectionofPseudomonasaeruginosainpackageddrinkingRapiddetectionofPseudomonasaeruginosainpackageddrinkingwater—Colloidalgoldimmunochromatographicassay2024073020240830安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布.前 言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由安徽省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院提出。本文件由安徽省市場監(jiān)督管理局歸口。包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速檢測膠體金免疫層析法范圍本文件規(guī)定了包裝飲用水中銅綠假單胞菌的膠體金免疫層析快速檢測方法。本文件適用于包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測。（GB/T6682分析實(shí)驗室用水規(guī)格和試驗方法GB8538食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗方法本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。原理樣品中的銅綠假單胞菌經(jīng)濾膜過濾富集，超聲處理提取DNA，以此為模板，設(shè)計經(jīng)異硫氰酸熒光素（biotin）（PCR）FITC（T線（C線除另有說明外，所用試劑均為分析純。水：試驗用水符合GB/T6682：CMCC（B）10282（Tris）。（HCl）。（NaOH）。Tris-HCl溶液：稱取Tris（5.3）6.06g，加水（5.1）40mL溶解，調(diào)pH至8.0，加水（5.1）定容至50mL。EDTAED-2?2H2（5.306（5.35mLNaH（.）pH8.0（5.1）50mL。TE1mLTris-HCl（5.7）100mL0.2mLEDTA（5.8）（5.1）100mL。4PCRDNA（dNTP）（MgCl2）（ddH2O）。Tris-HCl2020000。20h～24h（5.2）培養(yǎng)18h～201×108CFU/mL～5×108CFU/mL時，即制得銅綠假單胞菌菌懸液。引物：上游引物 5’-Biotin-GGCATTCAGATTGCTGCTCG-3’ ，下游引物5’-FITC-ACCGCCGTCAGAATCAGTTT-3’。PCR0.01g0.001。47mm，微孔徑為0.45μm5000rpmpH）。檢測將250mL待檢水樣通過孔徑0.45μm的無菌濾膜（6.7）過濾，濾膜備用。以無菌水作為空白對照，以銅綠假單胞菌菌懸液（5.14）作為陽性質(zhì)控對照。DNA提取將7.11mL的TE1.5mL5000rpm5minPCR擴(kuò)增取7.22PCR（5.10）12.5μmol/L各0.8μL，ddH2O（5.11）8.9μL?；靹蚝筮M(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃再延伸2min，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，備用。測定取7.3得到的擴(kuò)增產(chǎn)物2μL，滴加在膠體金免疫層析檢測試紙條（6.11）上，再滴加48μL上樣緩沖液（5.12）于樣品墊上，靜置3min，觀察T線和C線顯色情況，進(jìn)行結(jié)果判定。8結(jié)果判定無效控制線（C線）不顯色，或空白試驗檢測線（T線）顯色，或陽性質(zhì)控試驗檢測線（T線）不顯色，均判定無效。示意圖見圖1。陰性控制線（C線）顯色，檢測線（T線）不顯色。陽性控制線（C線）與檢測線（T線）均顯色。參比標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果為陽性時可采用參比標(biāo)準(zhǔn)GB8538進(jìn)行確認(rèn)。圖1目視判定示意圖圖1目視判定示意圖9性能指標(biāo)檢出限檢出限為1CFU/250mL。靈敏度靈敏度≥95%。特異性特異性≥95%。假陰性率假陰性率≤5%。假陽性率≤5%。見附錄A。附錄A（資料性）定性方法性能指標(biāo)計算方法性能指標(biāo)計算表見表A.1。表A.1性能指標(biāo)計算表樣品情況a檢測結(jié)果b總數(shù)陽性陰性陽性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異（х2）2（12-21-1）2/（1221自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對準(zhǔn)確度，%c（N11+N22）/