第二十章 高效液相色譜課件

第二十章高效液相色譜(20110512)第二十章高效液相色譜§20-1概述§20-2高效液相色譜儀§20-3液固色譜法§20-4液液色譜法§20-5化學(xué)鍵合相色譜法§20-6離子交換色譜法§20-7排阻色譜法§20-8色譜分離方法的選擇

第二十章高效液相色譜(20110512)導(dǎo)學(xué)

以色譜法導(dǎo)論和氣相色譜法兩章為基礎(chǔ)，通過(guò)學(xué)習(xí)，掌握分離原理及分類(lèi)，了解液相色譜和氣相色譜的異同，對(duì)高效液相色譜儀的流程了解的前提下，注意梯度洗脫裝置；對(duì)本章中提及的幾種液相色譜法，應(yīng)側(cè)重掌握其原理和其固定相及流動(dòng)相的要求，主要是化學(xué)鍵合相色譜法，而對(duì)“色譜分離方法的選擇”，是對(duì)P445的表進(jìn)行理解。第二十章高效液相色譜(20110512)§20-1概述一、高效液相色譜法二、液相色譜分離原理及分類(lèi)第二十章高效液相色譜(20110512)高壓液相色譜法在液相色譜普及之前，紙色譜法、氣相色譜法和薄層色譜法是色譜分析法的主流。到了20世紀(jì)60年代后期，將已經(jīng)發(fā)展得比較成熟的氣相色譜的理論與技術(shù)應(yīng)用到液相色譜上來(lái)，使液相色譜得到了迅速的發(fā)展。特別是填料制備技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)和高壓輸液泵性能的不斷改進(jìn)，使液相色譜分析實(shí)現(xiàn)了高效化和高速化。這種分離效率高、分析速度快的液相色譜就被稱(chēng)為高效液相色譜法，也稱(chēng)高壓液相色譜法或高速液相色譜法。

第二十章高效液相色譜(20110512)分離原理色譜分離的實(shí)質(zhì)是樣品分子（以下稱(chēng)溶質(zhì)）與溶劑（即流動(dòng)相或洗脫液）以及固定相分子間的作用力，作用力的大小，決定色譜過(guò)程的保留行為。第二十章高效液相色譜(20110512)§20-2高效液相色譜儀

高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等五大部分組成。第二十章高效液相色譜(20110512)一、高壓輸液系統(tǒng)

高壓輸液系統(tǒng)由溶劑貯存器、高壓泵、梯度洗脫裝置和壓力表等組成。1、溶劑貯存器2、高壓輸液泵

3、梯度洗脫裝置第二十章高效液相色譜(20110512)輸液泵

高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。對(duì)于帶在線脫氣裝置的色譜儀，流動(dòng)相先經(jīng)過(guò)脫氣裝置再輸送到色譜柱。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。第二十章高效液相色譜(20110512).

對(duì)輸液泵的基本要求流量準(zhǔn)確可調(diào)。流動(dòng)相的流速在0.5-2mL/min，輸液泵的最大流量一般為5-10mL/min。輸液泵的流量控制精度通常要求小于±0.5%。耐高壓。高效液相色譜柱是將很細(xì)顆粒（3-10um粒徑）的填料，在高壓下填充到柱管中，為了保證流動(dòng)相以足夠大的流速通過(guò)色譜柱，需要足夠高的柱前壓。通常要求泵的輸出壓力達(dá)到30-60MPa的高壓。液流穩(wěn)定。輸液泵輸出的液流應(yīng)無(wú)脈動(dòng)。泵的死體積小。為了快速更換溶劑和適于梯度洗脫，泵的死體積通常要求小于0.5mL。泵的結(jié)構(gòu)材料應(yīng)耐化學(xué)腐蝕。第二十章高效液相色譜(20110512)輸液泵

輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對(duì)液相色譜分析來(lái)說(shuō)，輸液泵的流量穩(wěn)定性更為重要，這是因?yàn)榱魉俚淖兓瘯?huì)引起溶質(zhì)的保留值的變化，而保留值是色譜定性的主要依據(jù)之一。因此，恒流泵的應(yīng)用更廣泛。

輸液泵按工作方式分為氣動(dòng)泵和機(jī)械泵兩大類(lèi)。機(jī)械泵中又有螺旋傳動(dòng)注射泵、單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。第二十章高效液相色譜(20110512)脫氣裝置流動(dòng)相溶液往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡。氣泡進(jìn)入檢測(cè)器后會(huì)在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集后會(huì)變成大氣泡，大氣泡進(jìn)入流路或色譜柱中會(huì)使流動(dòng)相的流速變慢或出現(xiàn)流速不穩(wěn)定，致使基線起伏。氣泡一旦進(jìn)入色譜柱，排出這些氣泡則很費(fèi)時(shí)間。在熒光檢測(cè)中,溶解氧還會(huì)使熒光淬滅。溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液pH值發(fā)生變化。

目前，液相色譜流動(dòng)相脫氣使用較多的是離線超聲波振蕩脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。第二十章高效液相色譜(20110512)梯度洗脫裝置為什么要進(jìn)行梯度洗脫？

在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。第二十章高效液相色譜(20110512)梯度洗脫操作

線性梯度：在某一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動(dòng)相強(qiáng)度。

階梯梯度：直接從某一低強(qiáng)度的流動(dòng)相改變?yōu)榱硪惠^高強(qiáng)度的流動(dòng)相。

梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的輸送就是要將幾種組成的溶液混合后送到分離系統(tǒng)，因此，梯度洗脫裝置就是解決溶液的混合問(wèn)題，其主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。根據(jù)溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。

第二十章高效液相色譜(20110512)(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第二十章高效液相色譜(20110512)二、進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。液相色譜的進(jìn)樣方式有兩種。進(jìn)樣器：微量注射器和進(jìn)樣閥。

進(jìn)樣器要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好，進(jìn)樣時(shí)引起色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動(dòng)要很小?，F(xiàn)在的液相色譜儀所采用的手動(dòng)進(jìn)樣器幾乎都是耐高壓、重復(fù)性好和操作方便的六通閥進(jìn)樣器。

第二十章高效液相色譜(20110512)分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。

色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。

色譜填料：經(jīng)過(guò)制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10微米粒徑的球形顆粒。

色譜柱管：內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)250mm。

色譜柱：也稱(chēng)固定相，是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的,第二十章高效液相色譜(20110512)填料的結(jié)構(gòu)

色譜填料是由基質(zhì)和功能層兩部分構(gòu)成。

基質(zhì)：又常稱(chēng)作載體或擔(dān)體，通常制備成數(shù)微米至數(shù)十微米粒徑的球形顆粒，它具有一定的剛性，能承受一定的壓力，對(duì)分離不起明顯的作用，只是作為功能基團(tuán)的載體。常用來(lái)作基質(zhì)的有硅膠和有機(jī)高分子聚合物微球。

功能層：是通過(guò)化學(xué)或物理的方法固定在基質(zhì)表面的、對(duì)樣品分子的保留起實(shí)質(zhì)作用的有機(jī)分子或功能團(tuán)。填料的物理結(jié)構(gòu)：分為微孔型（或凝膠型）、大孔型（全多孔型）、薄殼型和表面多孔型四種類(lèi)型。第二十章高效液相色譜(20110512)四、檢測(cè)器

檢測(cè)器是液相色譜儀的三大關(guān)鍵部件之一。對(duì)檢測(cè)器的要求是，靈敏度高、重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對(duì)溫度和流量的變化不敏感等。第二十章高效液相色譜(20110512)檢測(cè)器的分類(lèi)

在液相色譜中，有兩種類(lèi)型的檢測(cè)器，一類(lèi)是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)。屬于這類(lèi)的檢測(cè)器有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。另一類(lèi)是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)。屬于這類(lèi)的檢測(cè)器有示差折光檢測(cè)器等。第二十章高效液相色譜(20110512)紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器

原理：基于Lambert-Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見(jiàn)光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。

UV-VIS檢測(cè)器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV-VIS對(duì)環(huán)境溫度、流速、流動(dòng)相組成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。

用UV-VIS檢測(cè)時(shí)，為了得到高的靈敏度，常選擇被測(cè)物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長(zhǎng)作檢測(cè)波長(zhǎng)。第二十章高效液相色譜(20110512)二極管陣列檢測(cè)器

以光電二極管陣列（作為檢測(cè)元件的UV-VIS檢測(cè)器。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長(zhǎng)的信號(hào)，然后，對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的三維譜圖。與普通UV-VIS檢測(cè)器不同的是，普通UV-VIS檢測(cè)器是先用單色器分光，只讓特定波長(zhǎng)的光進(jìn)入流動(dòng)池。而二極管陣列UV-VIS檢測(cè)器是先讓所有波長(zhǎng)的光都通過(guò)流動(dòng)池，然后通過(guò)一系列分光技術(shù)，使所有波長(zhǎng)的光在接受器上被檢測(cè)。第二十章高效液相色譜(20110512)第二十章高效液相色譜(20110512)直接紫外檢測(cè)：所使用的流動(dòng)相為在檢測(cè)波長(zhǎng)下無(wú)紫外吸收的溶劑，檢測(cè)器直接測(cè)定被測(cè)組分的紫外吸收強(qiáng)度。間接紫外檢測(cè)：使用具有紫外吸收的溶液作流動(dòng)相，間接檢測(cè)無(wú)紫外吸收的組分。柱后衍生化光度檢測(cè)：對(duì)于那些可以與顯色劑反應(yīng)生成有色配合物的組分，可以在組分從色譜柱中洗脫出來(lái)之后與合適的顯色劑反應(yīng)，在可見(jiàn)光區(qū)檢測(cè)生成的有色配合物。第二十章高效液相色譜(20110512)示差折光檢測(cè)器

原理：基于樣品組分的折射率與流動(dòng)相溶劑折射率有差異，當(dāng)組分洗脫出來(lái)時(shí)，會(huì)引起流動(dòng)相折射率的變化，這種變化與樣品組分的濃度成正比。

絕大多數(shù)物質(zhì)的折射率與流動(dòng)相都有差異，所以RI是一種通用的檢測(cè)方法。雖然其靈敏度比其他檢測(cè)方法相比要低1-3個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)于那些無(wú)紫外吸收的有機(jī)物（如高分子化合物、糖類(lèi)、脂肪烷烴）是比較適合的。在凝膠色譜中是必備檢測(cè)器，在制備色譜中也經(jīng)常使用。

第二十章高效液相色譜(20110512)熒光檢測(cè)器

原理：許多有機(jī)化合物，特別是芳香族化合物、生化物質(zhì)，被一定強(qiáng)度和波長(zhǎng)的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長(zhǎng)要長(zhǎng)的熒光。熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度、量子效率和樣品濃度成正比。有的有機(jī)化合物雖然本身不產(chǎn)生熒光，但可以與發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測(cè)。特點(diǎn)：有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測(cè)法高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。而且所需樣品量很小，特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析。第二十章高效液相色譜(20110512)電導(dǎo)檢測(cè)器（conductivitydetector,CD）

原理：基于離子性物質(zhì)的溶液具有導(dǎo)電性，其電導(dǎo)率與離子的性質(zhì)和濃度相關(guān)。電導(dǎo)檢測(cè)器是離子色譜中必備的檢測(cè)器。

電導(dǎo)池是其核心。

電導(dǎo)池的結(jié)構(gòu)：檢測(cè)體積可達(dá)到微升甚至納升級(jí)?；窘Y(jié)構(gòu)是在柱流出液中放置兩根電極，然后通過(guò)適當(dāng)?shù)碾娮泳€路測(cè)量溶液的電導(dǎo)。第二十章高效液相色譜(20110512)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器

基于溶質(zhì)的光散射性質(zhì)的檢測(cè)器。由霧化器、加熱漂移管、激光光源和光檢測(cè)器等部件構(gòu)成。因?yàn)樯⑸涔鈴?qiáng)只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)，所以ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測(cè)器。適合于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)。其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光源強(qiáng)度等參數(shù)有關(guān)。與示差折光檢測(cè)器相比，它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。第二十章高效液相色譜(20110512)第二十章高效液相色譜(20110512)三、影響分離的因素

在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，而只有兩項(xiàng)，即：

H=A+Cu

故高效液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示：

影響分離的主要因素有流動(dòng)相的流量、性質(zhì)和極性。第二十章高效液相色譜(20110512)1.影響分離的因素——流速

流速大于0.5cm/s時(shí),H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。第二十章高效液相色譜(20110512)2.固定相及分離柱

氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。選擇短柱、細(xì)內(nèi)徑提高分析速度；研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。第二十章高效液相色譜(20110512)液相色譜流動(dòng)相（1）能溶解樣品，但不能與樣品發(fā)生反應(yīng)。（2）與固定相不互溶，而使柱效下降或損壞柱子。也不發(fā)生不可逆反應(yīng)。（3）粘度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效（4）應(yīng)與所用檢測(cè)器相匹配。例如利用紫外檢測(cè)器時(shí)，溶劑要不吸收紫外光。（5）容易精制、純化、毒性小，不易著火、價(jià)格盡量便宜等。第二十章高效液相色譜(20110512)3.流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性

（1）可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動(dòng)相又稱(chēng)為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱(chēng)為正相液液色譜法，極性柱也稱(chēng)正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱(chēng)為反相液液色譜，非極性柱也稱(chēng)為反相柱。組分在兩種類(lèi)型分離柱上的出峰順序相反。第二十章高效液相色譜(20110512)流動(dòng)相組成

流動(dòng)相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑:

己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。第二十章高效液相色譜(20110512)§20-3液固色譜法

液-固色譜的固定相是固體吸附劑。吸附劑是一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心。因此，液固色譜法是根據(jù)各組分在固定相上的吸附能力的差異來(lái)進(jìn)行分離的，故也稱(chēng)液固吸附色譜。第二十章高效液相色譜(20110512)吸附色譜的分離機(jī)理隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小在色譜柱上的保留由長(zhǎng)到短第二十章高效液相色譜(20110512)

吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。洗脫次序∶一般為正相，即：極性低的先被洗脫常用的流動(dòng)相∶非極性有機(jī)溶劑，如己烷常用固定相∶硅膠、氧化鋁。第二十章高效液相色譜(20110512)二、LSC固定相

液固吸附色譜法采用的固體吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性?xún)煞N類(lèi)型。非極性吸附劑最常見(jiàn)的是活性炭。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁等。極性吸附劑可進(jìn)一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠等，堿性吸附劑有氧化鋁等。酸性吸附劑適于分離堿，如芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、和吡咯衍生物等。第二十章高效液相色譜(20110512)流動(dòng)相的選擇

在液一固色譜中，選擇流動(dòng)相的基本原則是極性大的試樣用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，極性小的則用低極性流動(dòng)相。第二十章高效液相色譜(20110512)應(yīng)用由于硅羥基活性點(diǎn)在硅膠表面常按一定幾何規(guī)律排列，因此吸附色譜用于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離仍是最有效的方法。如農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離第二十章高效液相色譜(20110512)1、脲和氨基甲酸酯的分離硝基苯胺異構(gòu)體的分離第二十章高效液相色譜(20110512)§20-4液液色譜法一、分離原理二、固定相三、流動(dòng)相四、應(yīng)用實(shí)例第二十章高效液相色譜(20110512)分配色譜的分離機(jī)理基于樣品分子在流動(dòng)相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實(shí)現(xiàn)分離的液相色譜分離模式第二十章高效液相色譜(20110512)分配色譜概述反相色譜的主要類(lèi)型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流動(dòng)相：有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水應(yīng)用添加劑，成為離子對(duì)、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)反相色譜固定相多為鍵合相第二十章高效液相色譜(20110512)流動(dòng)相

在液液色譜中，除一般要求外，還要求流動(dòng)相對(duì)固定相的溶解度盡可能小。因此，固定液和流動(dòng)相的性質(zhì)往往處于兩個(gè)極端。以極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑作流動(dòng)相的液液分配色譜，被稱(chēng)為正相分配色譜，適合于分離極性化合物；選用非極性物質(zhì)為固定相，而極性溶劑為流動(dòng)相的液一液色譜稱(chēng)為反相分配色譜，這種色譜方法適合于分離芳烴，稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物。

第二十章高效液相色譜(20110512)四、應(yīng)用實(shí)例用反相LLC分離各稠環(huán)芳烴第二十章高效液相色譜(20110512)§20-5化學(xué)鍵合相色譜法

化學(xué)鍵合相色譜指在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行物質(zhì)分離的一種液體色譜方法。根據(jù)鍵合相與流動(dòng)相之間相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。反相色譜在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛。第二十章高效液相色譜(20110512)鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn)∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑消除硅羥基的不良影響缺點(diǎn)∶pH值不能小于3同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同第二十章高效液相色譜(20110512)一、化學(xué)鍵合固定相法

化學(xué)健合固定相一般都采用硅膠（薄殼型或全多孔微粒型）為基體。在鍵合反應(yīng)之前，要對(duì)硅膠進(jìn)行酸洗、中和、干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機(jī)物或有機(jī)硅化合物起反應(yīng)，制備化學(xué)鍵合固定相。鍵合相可分為下列四種鍵型。

1、硅酸酯型

2、硅氮型

3、硅碳型

4、硅氧烷型第二十章高效液相色譜(20110512)二、反相鍵合相色譜法

在反相色譜中，一般采用非極性鍵合固定相，用強(qiáng)極性的溶劑為流動(dòng)相。

目前，對(duì)于反相色譜的保留機(jī)制還沒(méi)有一致的看法，大致有兩種觀點(diǎn)，一種認(rèn)為屬于分配色譜，另一種認(rèn)為屬于吸附色譜。第二十章高效液相色譜(20110512)分離機(jī)制

疏溶劑理論第二十章高效液相色譜(20110512)三、正相鍵合相色譜法

此法是以極性的有機(jī)基團(tuán)鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑中加入適量的極性溶劑為流動(dòng)相，分離極性化合物。此時(shí)，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動(dòng)相是正己烷

這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類(lèi)型的化合物。第二十章高效液相色譜(20110512)反相HPLC由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠，代表性的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機(jī)物質(zhì)的分離。第二十章高效液相色譜(20110512)化學(xué)鍵合相色譜法的優(yōu)點(diǎn)（1）適用于分離幾乎所有類(lèi)型的化合物（2）特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件（3）有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性（4）柱效高，使用周期長(zhǎng)，分析重現(xiàn)性好第二十章高效液相色譜(20110512)§20-6離子交換色譜法一、分離原理二、固定相三、流動(dòng)相四、應(yīng)用第二十章高效液相色譜(20110512)應(yīng)用

此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。第二十章高效液相色譜(20110512)分離原理

離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹(shù)脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換。第二十章高效液相色譜(20110512)離子交換樹(shù)脂的分離機(jī)理第二十章高效液相色譜(20110512)離子交換色譜概述適用于離子型化合物的分離分離基于離子的帶電特性洗脫次序受多種因素的影響填料（離子交換樹(shù)脂）的種類(lèi)∶陰/陽(yáng)，強(qiáng)/弱，交換基團(tuán)樣品分子特性鹽的種類(lèi)、濃度溫度及pH值有機(jī)溶劑第二十章高效液相色譜(20110512)二、固定相第二十章高效液相色譜(20110512)三、流動(dòng)相

離子交換色譜的流動(dòng)相最常使用水緩沖溶液，有時(shí)也使用有機(jī)溶劑如甲醇，或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提供特殊的選擇性，并改善樣品的溶解度。

離子交換色譜所用的緩沖液，通常用下列化合物配制：鈉、鉀的檸檬酸鹽，磷酸鹽，甲酸鹽與其相應(yīng)的酸混合成酸性緩沖液或氫氧化鈉混合成堿性緩沖液等。第二十章高效液相色譜(20110512)離子對(duì)色譜

無(wú)機(jī)離子以及離解很強(qiáng)的有機(jī)離子通?？梢圆捎秒x子交換色譜或離子排斥色譜進(jìn)行分離。有很多大分子或離解較弱的有機(jī)離子需要采用通常用于中性有機(jī)化合物分離的反相（或正相）色譜。然而，直接采用正相或反相色譜又存在困難，因?yàn)榇蠖鄶?shù)可離解的有機(jī)化合物在正相色譜的硅膠固定相上吸附太強(qiáng)，致使被測(cè)物質(zhì)保留值太大、出現(xiàn)拖尾峰，有時(shí)甚至不能被洗脫。在反相色譜的非極性（或弱極性）固定相中的保留又太小。在這種情況下，就可采用離子對(duì)色譜。第二十章高效液相色譜(20110512)離子對(duì)色譜在流動(dòng)相中加入適當(dāng)?shù)木哂信c被測(cè)離子相反電荷的離子，即"離子對(duì)試劑"，使之與被測(cè)離子形成中性的離子對(duì)化合物，此離子對(duì)化合物在反相色譜柱上被保留。保留的大小主要取決于離子對(duì)化合物的解離平衡常數(shù)和離子對(duì)試劑的濃度。離子對(duì)色譜也可采用正相色譜的模式，即可以用硅膠柱，但不如反相色譜效果好，多數(shù)情況下采用反相色譜模式，所以離子對(duì)色譜也常稱(chēng)反相離子對(duì)色譜。第二十章高效液相色譜(20110512)§20-7排阻色譜法一、分離原理二、排阻色譜的填料和流動(dòng)相三、應(yīng)用第二十章高效液相色譜(20110512)一、分離原理

排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)——凝膠，它類(lèi)似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。第二十章高效液相色譜(20110512)分離原理第二十章高效液相色譜(20110512)固定相：化學(xué)惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝膠、親水凝膠、無(wú)機(jī)多孔材料。流動(dòng)相：

在凝膠色譜中，流動(dòng)相的作用不是為了控制分離，而是為了溶解樣品或減小流動(dòng)相粘度。

第二十章高效液相色譜(20110512)凝膠過(guò)濾色譜：以水或緩沖溶液作流動(dòng)相的凝膠色譜法。主要適合于水溶性高分子的分離。凝膠滲透色譜：

以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相的凝膠色譜法。主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的測(cè)定。第二十章高效液相色譜(20110512)二、排阻色譜的填料和流動(dòng)相第二十章高效液相色譜(20110512)三、應(yīng)用

排阻色譜主要被用于分離大分子物質(zhì)，其分離范圍從相對(duì)分子質(zhì)量2000～之間，這些物質(zhì)大多是生物化學(xué)物質(zhì)和聚合物等。此外，排阻色譜越來(lái)越多的應(yīng)用是通過(guò)測(cè)量相對(duì)分子質(zhì)量分布來(lái)鑒定高聚物及研究高聚物聚合機(jī)理、聚合工藝、條件等。第二十章高效液相色譜(20110512)§14-8色譜分離方法的選擇第二十章高效液相色譜(20110512)液相色譜的方法開(kāi)發(fā)第二十章高效液相色譜(20110512)第一步干什么?想辦法得到各種信息向同行了解是否做過(guò)此類(lèi)樣品，或有否類(lèi)似樣品的分析方法查文獻(xiàn)，如CA(化學(xué)文摘)對(duì)色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理，自己開(kāi)發(fā)方法充分了解您自己的樣品第二十章高效液相色譜(20110512)分析時(shí)要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復(fù)雜?有多少組份要分析?對(duì)分析的精密度、準(zhǔn)確度等有多高要求?是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用?第二十章高效液相色譜(20110512)分離時(shí)要了解哪方面的情況？要分離（即制備）的樣品量有多大?要分離的組份在樣品中的含量很高?還是微量?是否需要保持生物活性?對(duì)分離產(chǎn)物純度的要求有多高?純度或活性的鑒定如何完成?第二十章高效液相色譜(20110512)一般的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對(duì)較高的流速使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品先用高強(qiáng)度的洗脫液調(diào)節(jié)柱長(zhǎng)度改變柱效及分離速度第二十章高效液相色譜(20110512)使用文獻(xiàn)方法色譜柱填料的種類(lèi)、品牌是否相同?注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動(dòng)相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長(zhǎng)需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量第二十章高效液相色譜(20110512)反相色譜的方法開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)過(guò)程實(shí)例色譜條件∶色譜柱：C18，4mm×30mm流動(dòng)相：乙腈/水，不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱流速：1ml/min樣品：①對(duì)羥基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②對(duì)羥基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③對(duì)羥基苯甲酸丁酯(ButylParaben)第二十章高效液相色譜(20110512)改變?nèi)萘恳蜃?/p>

K'譜圖第二十章高效液相色譜(20110512)改變選擇性∶a通過(guò)改變流動(dòng)相改變選擇性同樣強(qiáng)度的不同溶劑改變色譜柱第二十章高效液相色譜(20110512)離子型化合物的分離方式使用離子交換柱∶離子交換法主要用于“強(qiáng)”陰、陽(yáng)離子使用反相柱離子抑制色譜法通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值，使樣品成中性離子對(duì)色譜法加入“對(duì)離子”，使樣品呈中性第二十章高效液相色譜(20110512)離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動(dòng)相的pH值，抑制樣品離子的電離適用于弱酸性化合物的分離降低流動(dòng)相的pH值，使樣品降低離子化使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險(xiǎn)值3-7）內(nèi)第二十章高效液相色譜(20110512)常用緩沖液及其pH值第二十章高效液相色譜(20110512)離子抑制色譜實(shí)例在乙腈/水及pH=7時(shí)，

多數(shù)保留時(shí)間很短，無(wú)

法完全分離。第二十章高效液相色譜(20110512)離子抑制色譜的使用范圍

如果： 一些酸在pH低于2時(shí)還保持離子化 一些堿在pH高于7時(shí)還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物反相柱，在pH高于7時(shí)用離子抑制法使用“離子對(duì)色譜法”第二十章高效液相色譜(20110512)離子對(duì)色譜法在反相色譜流動(dòng)相內(nèi)加入“離子對(duì)”試劑與樣品中可電離的組份形成“對(duì)離子”在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對(duì)試劑的類(lèi)型PICA：磷酸季丁銨，適用于弱酸PICB：烷基磺酸鹽，適用于弱堿第二十章高效液相色譜(20110512)離子對(duì)色譜機(jī)理第二十章高效液相色譜(20110512)結(jié)論充分用已知樣品結(jié)構(gòu)確定以哪種方法開(kāi)始普通反相?離子抑制?離子對(duì)?還是其他觀察流動(dòng)相條件改變時(shí)色譜峰的移動(dòng)根據(jù)變化的方向及大小決定下一步干什么改變參數(shù)時(shí)要合理，每次只改動(dòng)其中一個(gè)變量！色譜柱的改變影響最大第二十章高效液相色譜(20110512)毛細(xì)管電泳以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以電解質(zhì)為電泳介質(zhì)，以毛細(xì)管為分離通道，樣品組分依據(jù)淌度和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種色譜方法。它有多種分離模式，可以采用液相色譜中的各種檢測(cè)方