生物中圖版學(xué)案：第三章第一節(jié)酶的制備及活力測(cè)定

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精第一節(jié)酶的制備及活力測(cè)定1．研究酶的存在和簡(jiǎn)單制作方法。2．嘗試?yán)妹富盍y(cè)定的一般原理和方法。一、酶的粗提取1．提取方法酶是在生物體活細(xì)胞中合成的。多數(shù)酶在細(xì)胞內(nèi)直接參與生物化學(xué)反應(yīng)，少數(shù)的酶要分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。提取存在于細(xì)胞內(nèi)的酶，需要破碎生物組織細(xì)胞，可用破碎儀、研磨器或勻漿器等機(jī)械將組織細(xì)胞破碎，使酶從活細(xì)胞中釋放出來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞外的溶液中，經(jīng)過(guò)濾、離心制備成粗酶液.唾液淀粉酶、胰蛋白酶等分泌到細(xì)胞外的酶，可以直接從動(dòng)物分泌物或細(xì)胞外的組織間隙中提取。2．提取過(guò)程中影響酶活力的因素在酶的提取過(guò)程中，溫度、酸堿性等多種環(huán)境條件都可能影響酶的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶變性，直至喪失活力.二、酶的活力1．酶的活力檢測(cè)指標(biāo)酶的活力通常以單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量或者在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量來(lái)表示.例如，通過(guò)測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)麥芽糖的生成量來(lái)檢測(cè)淀粉酶的活力。由于麥芽糖與3,5－二硝基水楊酸試劑反應(yīng)，能生成黃褐色產(chǎn)物,因此,利用分光光度法進(jìn)行比色，可以測(cè)出麥芽糖的生成量。另外,還可以通過(guò)測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)淀粉的消耗量來(lái)檢測(cè)淀粉酶的活力。2．分光光度法分光光度法是通過(guò)直接測(cè)定溶質(zhì)對(duì)光的吸收能力來(lái)確定溶液濃度的方法。在定量分析時(shí)，首先配制一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在分光光度計(jì)上，選取特定的波長(zhǎng)，測(cè)出它們的吸光值。以各種標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。比色測(cè)定待測(cè)樣品時(shí)，操作條件應(yīng)與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)相同。測(cè)出吸光值后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出它的濃度，以計(jì)算出待測(cè)物質(zhì)的含量。三、植物淀粉酶的制備及活力測(cè)定1．材料的選擇萌發(fā)的水稻種子是提取淀粉酶的好材料。2．操作過(guò)程（1）提取酶液。（2)滴加酶液。(3）恒溫處理.（4）鈍化處理。(5)測(cè)定吸光值。（6）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.3．結(jié)果分析eq\o（\s\up7（淀粉酶活力),\s\do5(（mg·g－1·min－1）)）＝eq\f((A－A′)×樣品稀釋總體積,樣品鮮重×V×t）式中：A為淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖量（在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得，mg);A′為淀粉酶的對(duì)照管中的麥芽糖量(mg)；V為比色時(shí)所用樣品液體積(mL）;t為酶促反應(yīng)時(shí)間（min）。四、過(guò)氧化氫酶粗酶液的制備及活力測(cè)定1．制備過(guò)氧化氫酶粗酶液以新鮮動(dòng)物肝臟、馬鈴薯塊莖或蘿卜塊根為材料,經(jīng)過(guò)切碎、研磨、離心，取上清液即可得到過(guò)氧化氫酶粗酶液。2．分光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫酶的活力在過(guò)氧化氫酶存在時(shí)，過(guò)氧化氫將愈創(chuàng)木酚氧化生成茶褐色產(chǎn)物，這種產(chǎn)物在波長(zhǎng)470nm處有最大吸收峰。待酶反應(yīng)終止后，過(guò)濾,取濾液適當(dāng)稀釋,在波長(zhǎng)470nm處測(cè)吸光值，計(jì)算出過(guò)氧化氫酶的活力.3．高錳酸鉀滴定法測(cè)定過(guò)氧化氫酶的活力過(guò)氧化氫酶可以催化H2O2分解為水和氧。如果在反應(yīng)系統(tǒng)中加入適當(dāng)過(guò)量的過(guò)氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，在酸性條件下，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液滴定多余的H2O2,反應(yīng)如下：5H2O2＋2KMnO4＋4H2SO4→5O2＋2KHSO4＋8H2O＋2MnSO4根據(jù)消耗的H2O2的量計(jì)算出過(guò)氧化氫酶的活力。酶活力用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示。1．酶活力所謂酶活力，指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力.酶活力的測(cè)定實(shí)質(zhì)是測(cè)定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度.酶反應(yīng)的速度可以用單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示,酶反應(yīng)的速度愈快所表示的酶活力愈高。測(cè)定酶活力，可用物理法、化學(xué)法或酶分析法等方法。常用的方法有：第一,在適當(dāng)?shù)臈l件下，把酶和底物混合，測(cè)定生成一定量產(chǎn)物所需的時(shí)間，此即終點(diǎn)法.第二,將酶和底物混合后隔一定時(shí)間，間斷地或連續(xù)地測(cè)定反應(yīng)的連續(xù)變化，如吸收度的增加或減少。第三，將酶與底物混合后，讓其反應(yīng)一定時(shí)間，然后停止反應(yīng)，定量測(cè)定底物減少或產(chǎn)物生成的量。酶的活性單位(國(guó)際單位IU）:指在25℃下，以最適的底物濃度、最適的緩沖液離子強(qiáng)度以及最適的pH等條件下，1分鐘能轉(zhuǎn)化1μmol底物的酶量定為1個(gè)活性單位。2．測(cè)定酶活力時(shí)的注意事項(xiàng)（1）酶促反應(yīng)過(guò)程中，只有最初一段時(shí)間內(nèi)反應(yīng)速度與酶濃度成正比，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)速度即逐漸降低。（2）要規(guī)定一定的反應(yīng)條件，如時(shí)間、溫度、pH等，并在酶測(cè)定過(guò)程中保持這些反應(yīng)條件的恒定，如溫度不得超過(guò)規(guī)定溫度的±1℃，pH應(yīng)恒定。(3）配制的底物濃度應(yīng)準(zhǔn)確且足夠大，底物液中應(yīng)加入不抑制該酶活力的防腐劑并保存于冰箱中,以防止底物被分解。（4)標(biāo)本要新鮮，由于絕大多數(shù)酶可因久置而活力降低,標(biāo)本如無(wú)法及時(shí)測(cè)定,應(yīng)保存于冰箱中。用血漿時(shí)，應(yīng)考慮到抗凝劑對(duì)酶反應(yīng)的影響。有些酶在血細(xì)胞、血小板中的濃度比血清高,為此在采血、分離血清時(shí)，應(yīng)注意防止溶血和白細(xì)胞的破裂。(5)在測(cè)定過(guò)程中,所用儀器應(yīng)絕對(duì)清潔，不應(yīng)含有酶的抑制物,如酸、堿、蛋白沉淀劑等。題型一酶的特性【例題1】酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的.下列關(guān)于酶的論述，錯(cuò)誤的是（）.A．絕大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)B．酶的數(shù)量因參與化學(xué)反應(yīng)而消耗C．酶活性與pH有關(guān)D．酶的催化效率很高解析：酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化能力的有機(jī)物。其中絕大多數(shù)酶是蛋白質(zhì),其種類和數(shù)量的多少受基因控制，并且具有一般酶的特點(diǎn)，即參與一次化學(xué)反應(yīng)后，立即恢復(fù)到原來(lái)的狀態(tài)，繼續(xù)參與反應(yīng)。答案：B反思領(lǐng)悟：酶的特性是具有高效性、專一性和多樣性，酶的催化作用受溫度和pH的影響。題型二酶活力的測(cè)定【例題2】關(guān)于淀粉酶的制備和活力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)，說(shuō)法錯(cuò)誤的是（)。A．提取淀粉酶最好用萌發(fā)的水稻種子,因?yàn)榇藭r(shí)淀粉酶含量高B．催化淀粉水解的反應(yīng)要在pH＝5。6的緩沖液中進(jìn)行，使反應(yīng)體系的酸堿度穩(wěn)定C．淀粉與酶反應(yīng)后，在測(cè)定吸光值前加NaOH的目的是中和反應(yīng)體系中的酸性物質(zhì)D．在樣品溶液中加入3,5－二硝基水楊酸試劑后，要在沸水浴中煮沸5min后再比色解析：淀粉與酶反應(yīng)后，在測(cè)定吸光值前加NaOH溶液，目的是鈍化酶的活性，使反應(yīng)終止.答案：C1下列關(guān)于酶的說(shuō)法,不正確的是（）。A．絕大多數(shù)酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化能力的一類特殊的蛋白質(zhì)，合成場(chǎng)所為核糖體B．參加反應(yīng)的前后，酶的化學(xué)性質(zhì)不變C．酶的活性受環(huán)境中pH和溫度的影響D．酶在細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮作用,離開細(xì)胞即失效解析:酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的，但酶發(fā)揮作用并不一定都在細(xì)胞內(nèi)。如各類消化酶是消化腺細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的，在消化道內(nèi)消化有機(jī)物。答案:D2酶反應(yīng)速度可用哪一項(xiàng)來(lái)表示？（)A．單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物的減少量B．單位體積內(nèi)產(chǎn)物的增加量C．單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的增加量D．單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中反應(yīng)物的減少量或產(chǎn)物的增加量解析：酶反應(yīng)速度是衡量