熒光免疫技術（免疫學檢驗課件）

熒光免疫技術熒光免疫技術是將抗原抗體反應的特異性與熒光檢測技術的敏感性和直觀性相結合而建立的一種標記免疫技術。前言常用的熒光物質熒光物質最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應用異硫氰酸熒光素(FITC)490nm～495nm520nm～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明(RB200)570nm～575nm595nm～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT藻紅蛋白（PE）490nm-560nm595nm（紅色）雙標記FAT、流式細胞術碘化丙啶（PI）488nm620nm橙紅色Eu3+螯合物340nm613nm時間分辨熒光免疫測定熒光抗體的制備熒光素攪拌法透析法制備免疫血清親和層析離子交換層析法純化抗體標記抗體純化透析法凝膠過濾法鑒定實際應用第二節(jié)熒光免疫顯微技術

定性和定位檢測，或對自身抗體進行定性和滴度測定

熒光素標記抗體與標本片中組織或細胞抗原結合，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察呈現特異性熒光的抗原抗體復合物及其存在部位。

AbF+Ag（組織/細胞）AbF-Ag檢測特異性熒光紫外線一、基本原理二、方法類型1.直接法2.間接法3.雙標記法固定Ag（待測）＋Ab*——AgAb*快，直接、干擾因素少；常用于檢測Ag

特異性高但敏感度偏低檢測一種Ag，需標記一種Ab，較麻煩Ag？

AbF直接法制備一種熒光抗體，可檢測多種Ag或Ab既可檢測Ag，又可檢測Ab。靈敏度高間接法熒光素標記抗抗體AgAb抗－Ab*雙標記法兩種熒光素分別標記兩種不同的特異性抗體，與同一標本不同抗原表位反應，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。如：具CD3、CD4表位的Th細胞。ThCD3CD4（FITC黃綠）（RB200橘紅）三、關鍵技術1.標本制作2.熒光抗體染色3.熒光顯微鏡檢查4.熒光抗體染色結果判讀標本制作組織切片：冷凍切片、石蠟切片印片：肝、脾、淋巴結等器官或組織涂片：各種體液、穿刺液、細菌和細胞懸液培養(yǎng)細胞：單層培養(yǎng)細胞冷凍切片：操作簡單，抗原損失少，組織細胞結構欠清晰石蠟切片：組織細胞結構清楚，抗原損失多固定劑：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等

保存：4℃、-20℃熒光抗體染色于已固定的標本上滴加相關試劑（含適當稀釋的熒光抗體），置濕盒內25℃～37℃溫育30分鐘左右或4℃過夜；然后用PBS充分洗滌，待干燥后鏡檢。熒光顯微鏡檢查（熒光顯微鏡）

光源：高壓汞燈氙燈或鹵素燈濾光片：隔熱、激發(fā)和吸收光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野相差聚光器鏡頭：消色差鏡頭隔熱濾光片：阻斷紅外線通過而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，使紫外線（激發(fā)光）透過。吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，保護眼睛。熒光顯微鏡的基本結構透射光：照明光線從標本下方經聚光器透過標本進入物鏡。落射光：照明光線從標本上方落射到標本上，經反射進入物鏡。透射熒光光路(a)落射熒光光路(b)熒光顯微鏡光路圖光路熒光顯微鏡的基本結構設立實驗對照:陽性對照和陰性對照區(qū)分特異和非特異染色陽性細胞顯色分布:胞質型、胞核型和膜表面型三、熒光抗體染色及結果判斷熒光顯微鏡檢查（結果判斷）

“-”：無或極微弱“+”：較弱但清晰可見“++”：明亮“+++”：耀眼對照光：“-”或“±”陽性：特異熒光強度“+”以上效價：呈"+"的血清最高稀釋度四、方法評價與應用方法評價優(yōu)點：可用于抗原或抗體的定位、定性檢查，既有抗原抗體反應的高度特異性，又能在熒光顯微鏡下清晰地顯示其形態(tài)，直觀性強。缺點：熒光容易消退，難以制備永久性標本，非特異熒光常干擾結果判斷。第四節(jié)應用自身抗體檢測抗核抗體(均質型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點型)一、熒光抗體技術的應用臨床應用病原體檢測寄生蟲（猴胚腎細胞內弓形蟲）熒光抗體技術的應用細菌（藤黃微球菌)熒光免疫技術可用于淋巴細胞表面CD抗原、抗原受體、補體受體、Fc受體等的檢測以及淋巴細胞及其亞群的鑒定和計數。熒光抗體技術的應用細胞表面抗原和受體檢測其他：如免疫病理、腫瘤等檢測腫瘤抗原（人肝癌細胞）熒光抗體技術的應用第三節(jié)時間分辨熒光免疫測定（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)時間分辨熒光免疫測定（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

用鑭系元素標記抗原或抗體，并與時間分辨技術相結合而建立的一種新型超微量物質免疫分析方法，具有靈敏度高、特異性強、發(fā)光穩(wěn)定、自然熒光干擾少、標準曲線范圍寬等特點，已在臨床實驗中廣泛應用。AgEu3＋/AbEu3＋+Ag/Ab檢測一、基本原理AgEu3＋-Ab/AbEu3＋-Ag?Ab/Ag

熒光壽命長：10μs-1000μs，時間差—

時間分辨

Stokes位移大：270nm，易分辨時間分辨短壽命熒光長壽命熒光Eu3+元素的stokes位移二、方法類型12

3雙抗體夾心法固相抗體競爭法固相抗原競爭法Eu增強液激發(fā)Eu固相Ab待檢AgEu標記Ab每一步均需洗滌Eu解離發(fā)光雙抗體夾心法增強液激發(fā)固相AbAg？AgEu3+熒光強度與待檢抗原含量成負相關固相抗體競爭法增強液激發(fā)固相AgAg？AbEu3+熒光強度與待檢抗原含量成負相關固相抗原競爭法三、方法評價

靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L分析范圍寬：4～5個數量級

標記物穩(wěn)定：有效使用期長

測量快速，易自動化易受污染，本底增高四、臨床應用廣泛用于微量或超微量物質的檢測，如各種激素（肽類激素、甲狀腺激素、類固醇激素等）、蛋白質、酶、藥物、腫瘤標記物及病毒抗原等的測定。第四節(jié)熒光偏振免疫測定（fluorescencepolarizationimmunoassay,FPIA）

熒光偏振免疫測定是利用抗原抗體競爭反應原理，根據熒光素標記抗原與其抗原抗體復合物之間熒光偏振程度的差異，測定液體中小分子物質的含量。熒光物質經單一平面的偏振光照射后，吸收光能并發(fā)出單一平面的偏振熒光的現象。一、基本原理

熒光物質經激發(fā)光照射后，可發(fā)出偏振熒光，其強弱程度與熒光分子的大小呈正相關熒光素標記的小分子抗原（AgF）偏振熒光弱；而形成的AgF-Ab分子增大，偏振熒光強反應體系中待測Ag與AgF競爭結合已知抗體，故待測Ag越多，形成AgF-Ab越少，游離AgF多，故待檢Ag含量與偏振熒光強度成反比

（一）FPIA原理熒光偏振免疫測定示意圖二、方法評價熒光素標記試劑穩(wěn)定，使用壽命長重復性好快速，易自動化適于小、中等分子物質檢測儀器設備昂貴，試劑盒專屬性強靈敏度較非均相熒光免疫測定法低三、臨床應用主要用于測定小分子抗原物質，是臨床藥物濃度測定的首選方法，目前已有多種藥物、激素、毒品和常規(guī)生化項目可以用本方法進行分析，如環(huán)孢素、苯妥英鈉、卡馬西平、地高辛、丙戊酸、苯巴比妥、氨茶堿及鴉片濃度等測定。第五節(jié)免疫芯片技術（immunochip）

也稱抗體芯片，屬于蛋白質芯片的一種，是將抗原抗體結合反應的特異性與電子芯片高密度集成原理相結合而建立的一種全新概念的生物芯片檢測技術。一、基本原理免疫芯片是將幾個、幾十個，甚至幾萬個或更多數量的抗原（或抗體）高密度排列在固相載體上，形成高密度抗原或抗體的微點陣。與患者的少量待檢樣品或生物標本同時進行特異性免疫反應，可一次獲得芯片中所有已知抗原（或抗體）的檢測結果。二、方法類型12

3液體芯片抗體芯片細胞芯片三、關鍵技術芯片陣列項目合理組合陣列所需抗體庫的合理組合微陣列抗體或抗原固化抗原抗體在同一張芯片的集中用熒光等標記免疫技術等顯示結果生物樣品信息的獲取和分析四、方法評價基于高密度抗原或抗體的微陣列技術高通量取得生物信息信息量大、快速、及時、操作簡便所需樣品量少、生產成本低、用途廣泛自動化程度高等優(yōu)點。五、臨床應用

免疫芯片在臨床分子診斷學和許多疾病診斷方面具有廣泛而重要的應用價值。腫瘤標記物的檢測感染性疾病的檢測（如肝炎病毒、結核桿菌、幽門螺桿菌等）心血管疾病和自身免疫性疾病的檢測細胞膜表面抗原的檢測細胞因子的檢測、興奮劑的檢測高通量藥物篩選、環(huán)境和農業(yè)檢測食品衛(wèi)生、生物武器等方面的檢查。