淋巴管標(biāo)記物Podoplanin、D2-40在鼻咽癌組織中的表達(dá)及臨床意義

淋巴管標(biāo)記物Podoplanin、D2-40在鼻咽癌組織中的表達(dá)及臨床意義摘要】目的檢測兩種新的淋巴管特異標(biāo)記物Podoplanin、D2-40在鼻咽癌組織中的表達(dá)，探討它們在鼻咽癌中的臨床病理意義。方法63例確診中晚期鼻咽癌的患者隨機(jī)分為2組。治療組（32例）：rAd-p53瘤內(nèi)注射+同步放化療。對照組（31例）：同步放化療組。分別收集臨床資料及rAd-p53瘤內(nèi)注射前后鼻咽部瘤體活組織標(biāo)本。采用免疫組化二步法檢測鼻咽癌原發(fā)灶組織中淋巴管標(biāo)記物Podoplanin、D2-40的表達(dá)情況。結(jié)果治療組中Podoplanin、D2-40淋巴管計數(shù)均較治療前明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而對照組中Podoplanin、D2-40淋巴管計數(shù)較治療稍有下降，甚至上升,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論Podoplanin、D2-40可能與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),接受rAd-p53瘤內(nèi)注射的鼻咽癌患者Podoplanin、D2-40蛋白表達(dá)降低,MLVD數(shù)量下降,進(jìn)而降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險。

【關(guān)鍵詞】鼻咽癌rAd-p53淋巴管特異標(biāo)記物

【中圖分類號】R730【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】2095-1752（2012）32-0061-02

鼻咽癌是我國南方常見的頭頸部惡性腫瘤之一。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，治療失敗的主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。rAd-p53是通過腺病毒載體將野生型p53基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞發(fā)揮治療效應(yīng)，已成為一種有效的基因治療途徑。我們通過免疫組化檢測方法了解rAd-p53瘤內(nèi)注射前后Podoplanin、D2-40蛋白的表達(dá)情況，為rAd-p53治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1臨床資料

本組63名病例源于廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科在2007年01月～2010年06月收治的部分鼻咽癌患者，全部病例經(jīng)病理診斷為未分化非角化性癌，并按研究病例的納入條件、排除條件入組。入組病例按隨機(jī)分為2組，治療組：rAd-p53瘤內(nèi)注射+同步放化療，對照組：同步放化療。

1.2病例選擇方法

經(jīng)病理診斷為鼻咽癌，未行抗癌治療；全部病例均行鼻咽顱底CT（或MRI）、B超、X線及鼻內(nèi)窺鏡檢查了解病變范圍；按UICC（1997）鼻咽癌分期方案分期的Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者；年齡在20-60歲之間；卡氏評分≥70分；簽署知情同意書。

1.3治療方法

1.3.1放射治療

采用西門子Primus全數(shù)字化直線加速器常規(guī)體外照射，采用面頸聯(lián)合野照射36Gy后縮野，采用耳前野輔以鼻前野，原發(fā)灶70-76Gy/35f/7-8w，頸轉(zhuǎn)移灶60-70Gy。

1.3.2化學(xué)藥物治療

卡鉑+5-Fu方案。劑量按體表面積計算，卡鉑500mg（m2?d）-1，d1靜脈點滴，5-Fu500mg（m2?d）-1，d1-5，24小時微泵持續(xù)輸入，同時應(yīng)用昂丹司瓊注射液止吐治療，與放療同步進(jìn)行，28天后重復(fù)化療1次，共2個周期。

1.3.3rAd-p53瘤內(nèi)注射

重組人p53腺病毒注射液（rAd-p53,中國深圳賽百諾公司生產(chǎn)）劑量：1×1012VP/支，1次/周，治療6周；用法：用生理鹽水稀釋rAd-p53到2ml后使用，在鼻內(nèi)鏡直視下多點注入鼻咽部原發(fā)灶內(nèi)；用藥時間：于放療前48-72小時行瘤內(nèi)注射。

1.4鼻咽癌原發(fā)灶標(biāo)本獲取方法

分別于治療前及放療20Gy或鼻咽部瘤體組織即將消退前獲取活體組織標(biāo)本。用1％麻黃素液和1％的卡因液棉片行鼻腔、鼻咽部粘膜麻醉，在鼻內(nèi)窺鏡直視下于鼻咽部瘤體處應(yīng)用活檢鉗獲取活體組織標(biāo)本。

1.5試劑

免疫組化ElivisionTMplus二步法試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，DAB顯色試劑盒、鼠抗人Podoplanin、D2-40單克隆抗體均購于北京中杉生物技術(shù)公司。

1.6免疫組織化學(xué)檢測

全部標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片（4μm），HE染色，光鏡檢查。采用ElivisionTMplus二步法，根據(jù)試劑說明書操作進(jìn)行Podoplanin、D2-40蛋白檢測。

1.7圖像分析及結(jié)果判定

Podoplanin、D2-40陽性表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。微淋巴管計數(shù)（MLVD）方法采用Weidner法計數(shù)：先在低倍鏡下尋找新生脈管最密集的區(qū)域即熱點（hotspot），然后在高倍鏡下對淋巴管進(jìn)行計數(shù)，在腫瘤組織內(nèi)以5個高倍鏡視野脈管的平均數(shù)表示微淋巴管（MLVD）。

1.8隨訪

隨訪時間是2007年06月至2010年10月，隨訪方式是患者定期回院復(fù)查和專職隨訪員電話隨訪。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析

計數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有分析均使用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般資料

按照病例納入條件和排除條件入組病例63例，男52例，女11例，年齡在22～63歲之間。按UICC（1997）鼻咽癌分期方案分期：Ⅲ期37例，Ⅳ期26例。治療組入選病例32例，對照組入選病例31例。治療前兩組原發(fā)腫瘤大小、年齡、性別、臨床分期、T分期、N分期間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1兩組患者的一般情況

2.2Podoplanin及D2-40在鼻咽癌組織中的表達(dá)

Podoplanin及D2-40蛋白的陽性表達(dá)見于所有腫瘤組織，分布在腫瘤實質(zhì)和外周，呈一致性的管腔結(jié)構(gòu)，有一層薄壁，管腔內(nèi)很少有淋巴細(xì)胞，無紅細(xì)胞，腫瘤周邊淋巴管腔比實質(zhì)內(nèi)大，而且數(shù)量多。

2.3兩組治療前后Podoplanin蛋白的表達(dá)情況

治療組Podoplanin蛋白表達(dá)較治療前明顯降低，差異有顯著性意義（P＜0.05）。而對照組Podoplanin蛋白表達(dá)較治療前降低不明顯，差異無顯著性意義（P＞0.05）。見表2。

表2兩組患者治療前和治療后鼻咽癌原發(fā)灶podoplanin蛋白的表達(dá)情況

2.4兩組治療前后D2-40蛋白的表達(dá)情況

治療組D2-40蛋白表達(dá)較治療前明顯降低，差異有顯著性意義（P＜0.05）。而對照組D2-40蛋白表達(dá)較治療前降低不明顯，差異無顯著性意義（P＞0.05）。見表3。

表3兩組患者治療前和治療后鼻咽癌原發(fā)灶D2-40蛋白的表達(dá)情況

3討論

p53基因是正常細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的看家基因，是最重要的一個抑癌基因。其通過以下作用實現(xiàn)抑癌作用：①細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)損傷細(xì)胞修復(fù)；②誘導(dǎo)嚴(yán)重受損細(xì)胞凋亡；③調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)；④抑制生存增殖信號途徑；⑤抑制血管生成及物質(zhì)能量代謝；⑥抑制細(xì)胞—細(xì)胞黏附及其浸潤轉(zhuǎn)移。研究表明：50%以上人類腫瘤存在p53抑癌基因的突變或缺失，而且p53突變與腫瘤細(xì)胞對常規(guī)化療藥物及放射治療敏感性下降有關(guān)。實驗已證實，將野生型p53基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，可以控制細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增加腫瘤對化/放療的敏感性，還可通過旁觀者效應(yīng)達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。大量基礎(chǔ)和臨床前研究結(jié)果為p53治療應(yīng)用于腫瘤臨床提供了充分的依據(jù)和堅實的基礎(chǔ)。rAd-p53是將野生型p53基因插入缺陷型腺病毒構(gòu)建而成的國家I類新藥。

微血管和淋巴管系統(tǒng)一直被認(rèn)為在惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色。前些年，微血管生成的研究成為眾多學(xué)者的研究熱點。近年來，隨著系列淋巴管特異性標(biāo)志物，如腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白(Podoplanin)、D2—40、血管內(nèi)皮生長因子受體—3(VEGFR—3)、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸酶受體—1(LYVE—1)和Prox-1等的發(fā)現(xiàn)，對腫瘤新生淋巴管的研究逐步深入，這使得腫瘤淋巴管生成與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系研究成為繼腫瘤血管生成之后新的研究熱點。

podoplanin是一種相對分子質(zhì)量為38×103的I型跨膜糖蛋白，由162個氨基酸構(gòu)成，有1個單一高度保守的跨膜區(qū)域，胞內(nèi)域有9個氨基酸構(gòu)成，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的c端有2個潛在的磷酸化位點，胞外域隨物種不同而變異較大，但都有相對保守的6個潛在的氧連接型糖基化位點，唾液酸通過α-2，3連接在半乳糖上，構(gòu)成該蛋白的糖類主要部分。podoplanin在人體多種組織細(xì)胞中表達(dá)，如在腎足突細(xì)胞、骨骼肌、胎盤、肺和心臟、乳腺的肌成纖維細(xì)胞、唾液腺、成骨細(xì)胞和間皮細(xì)胞上，也在鼠肺泡I型上皮細(xì)胞膜上表達(dá)，偶爾在人表皮細(xì)胞的基底層上也能見到局部表達(dá)[7-8]，但主要表達(dá)在淋巴管內(nèi)皮上，是淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。我們通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)rAd-p53瘤內(nèi)注射后鼻咽癌原發(fā)灶組織中podoplanin蛋白表達(dá)較治療前明顯降低，差異有顯著性意義（P＜0.05）。而對照組podoplanin蛋白表達(dá)較治療前降低不明顯，反而有輕微的增高，差異無顯著性意義（P＞0.05）。

單克隆抗體D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，它是一種相對分子質(zhì)量為40000的唾液酸糖蛋白，大量研究表明D2舶特異的表達(dá)于正常和腫瘤組織的淋巴管，而不表達(dá)于伴隨的小血管，是目前最好的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物。我們通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)rAd-p53瘤內(nèi)注射后鼻咽癌原發(fā)灶組織中D2-40蛋白表達(dá)較治療前明顯降低，差異有顯著性意義（P＜0.05）。而對照組D2-40蛋白表達(dá)較治療前降低不明顯，反而有輕微的增高，差異無顯著性意義（P＞0.05）。

綜上所述，Podoplanin、D2-40可能與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),接受rAd-p53瘤內(nèi)注射的鼻咽癌患者Podoplanin、D2-40蛋白表達(dá)降低,MLVD數(shù)量下降,進(jìn)而降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險。所以我們有理由相信，rAd-p53可能通過某種機(jī)制抑制鼻咽癌組織內(nèi)淋巴管生成，從而抑制鼻咽癌的淋巴道轉(zhuǎn)移途徑，這正驗證了p53基因能夠抑制細(xì)胞—細(xì)胞黏附及其浸潤轉(zhuǎn)移的抑癌機(jī)制。參考文獻(xiàn)

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