DB32T 1770-2011 A 群豬輪狀病毒的檢測RT-PCR 方法

ICS65.020.30備案號：DB32江蘇省質量技術監(jiān)督局發(fā)布IDB32/T1770—2011為規(guī)范A群豬輪狀病毒分子生物學檢測技術，提高A群豬輪狀病毒檢測的靈敏度、穩(wěn)定性、特異性，特制定本標準。本標準按GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫》編寫。本標準的附錄A為規(guī)范性附錄。本標準由江蘇省農業(yè)科學院提出。本標準起草單位：江蘇省農業(yè)科學院。本標準起草人：倪艷秀、何孔旺、郭容利、溫立斌、呂立新、張雪寒、周俊明、李成仁、俞正玉、茅愛華、李彬、王小敏。1DB32/T1770—2011A群豬輪狀病毒的檢測RT-PCR方法本標準規(guī)定了A群豬輪狀病毒的檢測RT-PCR方法的所用儀器設備和主要試劑、引物、方法步驟、結果判定、廢棄物處理和防止污染的措施等技術標準。本標準適用于A群豬輪狀病毒的RT-PCR檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的，凡是注日期的引物文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB16548-2006病害動物和病害動物產品生物安全處理規(guī)程GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T541-2002動物疫病實驗室檢驗采樣方法3原理RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。本標準根據(jù)GenBank上公布的A群豬輪狀病毒（PRV）衣殼蛋白VP7基因序列，在其保守區(qū)設計一對特異性引物，先提取待檢樣品的RNA，用下游引物進行RT，再以cDNA為模板進行PCR。4儀器設備和主要試劑4.1儀器設備4.1.1高速離心機4.1.2PCR儀4.1.3核酸電泳儀4.1.4凝膠成像系統(tǒng)4.2主要試劑除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純。4.2.1焦碳酸二乙酯(DEPC)水4.2.2TRIzol4.2.3RNA酶抑制劑4.2.4AMV反轉錄酶4.2.5Taq酶4.2.6dNTP4.2.7瓊脂糖，電泳級2DB32/T1770—2011上游引物：5′-GTATGGTATTGAATATACCAC-3′；下游引物：5′-GATCCTGTTGGCCATCC-3′。6方法步驟試驗用水：按照GB/T6682-2008三級水標準。6.1樣品處理6.1.1糞便樣品的處理按照NY/T541-2002，采集腹瀉豬的糞便，在糞便中按1：10加入DEPC水，劇烈震蕩使其混和均勻，5000r/min，離心20min，取上清于-20℃?zhèn)溆?。反復凍融三次后，?000r/min，離心20min，取上清。陰性糞便對照：正常豬糞便。陽性糞便對照：感染A群豬輪狀病毒的豬糞便。陰性、陽性糞便對照也同樣處理，對每個樣品進行編號標記。另外，按照GB16548-2006處理待檢糞便。6.1.2可疑細胞培養(yǎng)物樣品的處理可疑細胞培養(yǎng)物反復凍融三次后，以5000r/min，離心20min，取上清。陰性細胞培養(yǎng)物對照：正常MA104細胞。陽性細胞培養(yǎng)物對照：A群豬輪狀病毒細胞培養(yǎng)物。陰性、陽性細胞培養(yǎng)物對照也同樣處理，對每個樣品進行編號標記。6.2RNA的提取在200μL上清中加入TRIzol800μL，振蕩混勻后，室溫放置5min，加入氯仿200μL，劇烈振蕩后，室溫放置10min，4℃12000r/min，離心10min，取上清，加入0.5mL異丙醇，混勻，-20℃放置2h以上，4℃12000rpm離心15min，去上清，沉淀用1ml75%的無RNA酶的乙醇洗滌，4℃7500r/min離心5min，去上清，室溫干燥RNA沉淀20min，加入DEPC水12μL，使充分溶解，-20℃凍存?zhèn)溆谩?.3RT-PCR6.3.1反應條件反轉錄反應：按20μL體系進行，5×Buffer4.0μL、dNTP（10mM）2.0μL、下游引物（50pmol/μL）1.0μL、RNA酶抑制劑0.5μL、RNA模板12.0μL，AMV反轉錄酶0.5μL，瞬間離心混勻，65℃反應15min，42℃孵育1h，95℃5min，同時設立陰性、陽性對照，產物于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應：按25μL體系進行，10×buffer2.5μL，MgCl2（25mM）1.0μL，dNTP（2.5mM）1.0μL，上游引物（50pmol/μL）0.5μL，下游引物（50pmol/μL）0.5μL，模板DNA3.0μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，滅菌水16.0μL。按如下條件進行PCR反應。95℃5min，然后進入循環(huán)94℃1min，55.0℃1min，72℃1min，35個循環(huán)，于72℃延伸10min，4℃保存。6.3.2電泳將PCR反應產物于1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓為120V，時間30min。DB32/T1770—20116.3.3結果觀察用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，并進行拍照。7結果判定7.1試驗結果成立條件陽性對照的PCR產物電泳后在342bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，陰性對照PCR產物電泳后沒有條帶，試驗結果成立;否則，結果不成立7.2結果判定7.2.1在試驗結果成立的前提下，如果檢測樣品中PCR產物電泳后在342bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，判為陽性，即該樣品為A群豬輪狀病毒核酸陽性。7.2.2在試驗結果成立的前提下，如果檢測樣品中PCR產物電泳后在342bp的位置上未出現(xiàn)一條特異性條帶，判為陰性，即該樣品為A群豬輪狀病毒核酸陰性。7.2.3如果陽性對照無相應的目的條帶，可能是存在操作失誤，該試驗需要做重復試驗；如果陰性對照有相應的目的條帶，可能是陰性對照存在污染或是操作失誤，該試驗需要做重復試驗。8廢棄物處理和防止污染的措施檢測過程中的廢棄物，應收集后高壓滅菌處理。檢測過程中防止交叉污染的措施見附錄A。4DB32/T1770—2011(規(guī)范性附錄)檢測過程中防止交叉污染的措施A.1抽樣和制樣過程抽樣和制樣工具，應清洗干凈，121℃,15～20min滅菌，一套清潔工具限于一個樣品使用。存放樣品的容器應該經過清洗、滅菌，或為一次性滅菌容器。A.2檢測過程A.2.1PCR實驗室應分為樣品制備區(qū)、前PCR區(qū)、PCR區(qū)、后PCR區(qū)。將模板提取、PCR反應液配制、PCR循環(huán)擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行。實驗室的運作應從“凈區(qū)”到“臟區(qū)”單方向進行。A.2.2實驗過程中，應穿實驗服和戴手套，手套要經常更換。各區(qū)要有專用實驗服，經常清洗。A.2.3各區(qū)所有的試劑、器材(尤其是移液器)、儀器都應專用，不得帶出該區(qū)。A.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121℃,15～20min滅菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每種溶液應使用高質量的成分和新蒸餾的雙蒸水。在20～25℃貯存的試劑中，可加0.025%的疊氮鈉。所有試劑應該以大體積配制，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。A.2.5裝有DNA模板或引物的離心管打開之前，要簡短離心，離心管不能用力崩開，以免產生氣溶膠。A.2.6前PCR區(qū)中，最好能在PCR操作箱中加人PCR反應各組分。A.2.7實驗前后，實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA。A.2.8可使用UDG和dUTP系統(tǒng)控制污染。DB32/T1770—2011(規(guī)范性附錄)RT-PCR擴增產物參考序列本標準參照的序列為GenBank上公布的PRV衣殼蛋白(vp7)部分基因序列(ORF2-342bp)1EF474079（阿根廷）Gtatggtattgaatataccacaattctaatcttcttgacatcgattacattgctaaattatatcttaaaatcaataacaagagtaatggactatataatttacagatttctgcttatagtggtaatcttggccaccatgataaatgcgcagaattatggag