第26章重組藥物

第26章

重組藥物本章目錄第一節(jié)重組藥物概述第二節(jié)重組藥物的通用制造方法與技術(shù)第三節(jié)重組藥物的分離純化技術(shù)關(guān)鍵第四節(jié)重組藥物的質(zhì)量控制第五節(jié)典型重組藥物制造技術(shù)及工藝

20世紀(jì)70年代建立的DNA重組技術(shù)帶來(lái)了生物技術(shù)新的變革，促進(jìn)了以基因工程技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)的誕生和發(fā)展，被認(rèn)為是20世紀(jì)人類(lèi)的一項(xiàng)最偉大的貢獻(xiàn)。DNA重組技術(shù)，亦稱(chēng)基因重組技術(shù)，是指將DNA片段（如基因）按人們的設(shè)計(jì)方案定向地與載體相連，并轉(zhuǎn)入特定的受體細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌（或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。應(yīng)用DNA重組技術(shù)表達(dá)和生產(chǎn)的多肽或蛋白質(zhì)類(lèi)藥物，稱(chēng)為重組藥物。第一節(jié)

重組藥物概述應(yīng)用DNA重組技術(shù)可大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白和多肽，提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理生化及結(jié)構(gòu)等進(jìn)行深入的研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用，還可以對(duì)已有的藥物進(jìn)行改造，克服其不足，創(chuàng)造自然界不存在的全新物質(zhì)。重組藥物制造的通用方法流程為：①獲得目的基因；②將目的基因和載體連接，構(gòu)建DNA重組體；③將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌；④工程菌的發(fā)酵；⑤外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化；⑥產(chǎn)物的檢驗(yàn)和制劑制備等。第二節(jié)重組藥物的通用制造方法與技術(shù)在操作過(guò)程中需注意：1、操作條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；2、選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來(lái)，達(dá)到較高的純化倍數(shù)；3、收率要高；4、兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對(duì)物料加以處理調(diào)整，這樣可以減少工藝步驟；5、整個(gè)分離純化過(guò)程要快，能夠滿(mǎn)足高生產(chǎn)率的要求。

重組藥物分離純化的一般流程為：固液分離、細(xì)胞破碎、提取、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工等。第三節(jié)

重組藥物的分離純化技術(shù)關(guān)鍵構(gòu)建好的基因工程菌在適當(dāng)條件下培養(yǎng)發(fā)酵，表達(dá)重組藥物后，還需選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x純化方法將產(chǎn)物提純，制成特定的制劑，才能被應(yīng)用于臨床。

而且基因工程菌培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)物中含有大量的細(xì)胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽等，而目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低，同時(shí)重組藥物一般都需注射給藥，對(duì)其質(zhì)量、純度要求高。為獲得合格的目的產(chǎn)物，必須建立與上述特點(diǎn)相適應(yīng)的分離純化工藝。分離純化重組藥物須重點(diǎn)考慮下列幾個(gè)技術(shù)因素：1.產(chǎn)物的表達(dá)形式2.根據(jù)蛋白產(chǎn)物性質(zhì)選用適宜的層析類(lèi)型3.分離單元之間的銜接4．分離純化工藝的要求1.產(chǎn)物的表達(dá)形式根據(jù)外源基因表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的定位，可將表達(dá)方式分為分泌型表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)。外源蛋白的分泌表達(dá)是通過(guò)將外源基因融合到編碼信號(hào)肽序列的下游來(lái)實(shí)現(xiàn)的。將外源基因接在信號(hào)肽之后，表達(dá)產(chǎn)物在信號(hào)肽的引導(dǎo)下跨膜分泌出胞外，同時(shí)在宿主細(xì)胞膜上存在特異的信號(hào)肽酶，它識(shí)別并切掉信號(hào)肽，從而釋放出有生物活性的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。分泌型表達(dá)產(chǎn)物的發(fā)酵液的體積很大，但濃度較低，因此必須在純化前富集或濃縮，可以用吸附、沉淀或超濾的方法來(lái)進(jìn)行富集或濃。如果表達(dá)產(chǎn)物前沒(méi)有信號(hào)肽序列，它可以可溶形式或不可溶形式（包涵體）存在于細(xì)胞中。對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，首先要通過(guò)離心或過(guò)濾的方式收集細(xì)胞，并采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄆ票?。在工業(yè)生產(chǎn)中常用大腸桿菌作為宿主菌來(lái)生產(chǎn)目的蛋白，在大腸桿菌中當(dāng)外源蛋白的表達(dá)量達(dá)到20%以上時(shí)，它們一般就會(huì)以包涵體（inclusionbody）的形式存在。如果蛋白質(zhì)以胞內(nèi)可溶表達(dá)形式存在，則收集菌體后破壁，離心取上清液，然后用親和層析或離子交換法進(jìn)行純化。在純化過(guò)程中還常采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施，如低溫、加入保護(hù)劑、盡量縮短純化工藝及時(shí)間等措施來(lái)防止產(chǎn)物的降解和破壞。外源蛋白的復(fù)性是利用包涵體獲得外源蛋白最關(guān)鍵也是最復(fù)雜的一步。重組蛋白的復(fù)性操作主要有兩種方法：一種是將溶液稀釋?zhuān)瑢?dǎo)致變性劑的濃度降低，促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性。

另外表達(dá)產(chǎn)物還可存在于大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)中，這是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)和分泌表達(dá)之間的一種形式，它可以避開(kāi)細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類(lèi)雜質(zhì)，在一定程度上有利于分離純化。大腸桿菌經(jīng)低濃度溶菌酶處理后，可采用滲透沖擊的方法來(lái)獲得周質(zhì)蛋白。缺點(diǎn)是滲透沖擊的方法破壁不完全，產(chǎn)物的收率較低。2.根據(jù)蛋白產(chǎn)物性質(zhì)選用適宜的層析類(lèi)型基因工程產(chǎn)物常需采用層析來(lái)進(jìn)行精制以達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)。在選擇層析類(lèi)型和條件時(shí)要綜合考慮蛋白質(zhì)的性質(zhì)。如蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和表面電荷的分布及目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。親和層析是一種高效的分離純化手段，不同的蛋白質(zhì)可以選用不同的特異性親和配基，如酶和底物、抗原與抗體、糖鏈和凝集素等。由于親和分離的選擇性強(qiáng)，因此在產(chǎn)物純化中具有較大的潛力；疏水作用層析和反相作用層析是利用蛋白質(zhì)疏水性的差異來(lái)分離純化蛋白質(zhì)。一般是目的蛋白與配基結(jié)合而雜蛋白不結(jié)合，目的蛋白吸附后再利用快速變換洗脫液和加入競(jìng)爭(zhēng)劑的方法進(jìn)行洗脫。

二者的不同在于疏水作用層析通常在水溶液中進(jìn)行，蛋白在分離過(guò)程中仍保持其天然構(gòu)象，而反相作用層析是在有機(jī)相中進(jìn)行，蛋白經(jīng)過(guò)反相流動(dòng)相與固定相的作用有時(shí)會(huì)發(fā)生部分變性；凝膠排阻層析根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量以及蛋白質(zhì)分子的動(dòng)力學(xué)體積的大小來(lái)進(jìn)行分離的，它可應(yīng)用于蛋白質(zhì)脫鹽和蛋白質(zhì)分子的分級(jí)分離。3.分離單元之間的銜接考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本，一般早期盡可能采用高效的分離手段，如通常先用非特異、低分辨的操作單元方法，以盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要的雜質(zhì)；然后采用高分辨率的操作方法，而將凝膠排阻色譜這類(lèi)分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元放在最后，以提高分離效果。當(dāng)幾種方法連用時(shí)，最好以不同的分離機(jī)制為基礎(chǔ)，而且經(jīng)前一種方法處理樣品應(yīng)能適合于作為后一種方法的料液。如果經(jīng)鹽析后得到的產(chǎn)品，不適宜于離子交換層析，但可直接應(yīng)用于疏水層析。離子交換、疏水及親和色譜通?？善鸬降鞍踪|(zhì)濃縮的效應(yīng)，而凝膠過(guò)濾色譜常常使樣品稀釋?zhuān)陔x子交換色譜之后進(jìn)行疏水層析色譜就很合適，不必經(jīng)過(guò)緩沖溶液的更換，因?yàn)槎鄶?shù)蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度下與疏水介質(zhì)結(jié)合較強(qiáng)。親和層析選擇性最強(qiáng)，但不能放在第一步，一方面因?yàn)殡s質(zhì)多，易受污染，降低使用壽命；另一方面，體積較大，需要大量的介質(zhì)，而親和層析介質(zhì)一般較貴。因此親和層析多放在第二步以后。有時(shí)為了防止介質(zhì)中毒，在其前面加一保護(hù)柱，通常為不帶配基的介質(zhì)。經(jīng)過(guò)親和層析后，還可能有脫落的配基存在，而且目的蛋白質(zhì)在分離和純化過(guò)程中會(huì)聚合成二聚體或更高的聚合物，特別是當(dāng)濃度較高，或含有降解產(chǎn)物時(shí)更易形成聚合體，因此最后需經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化操作，常使用凝膠過(guò)濾色譜，也可用高效液相色譜法，但費(fèi)用較高。4．分離純化工藝的要求在重組藥物分離純化過(guò)程中，通常需要綜合使用多種分離純化技術(shù)。另外，作為藥品，其生產(chǎn)必須保證安全、無(wú)菌、無(wú)熱源、無(wú)污染。1、分離純化工藝要求有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，減小原料及設(shè)備對(duì)產(chǎn)品的影響。2、工藝的步驟盡可能少，時(shí)間要盡可能短，以減少生物活性物質(zhì)的破壞失活。3、組成工藝的各技術(shù)、步驟之間及設(shè)備間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，且高效，收率高，易操作，對(duì)設(shè)備條件要求低，能耗低，并盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟或干擾產(chǎn)品質(zhì)量。第四節(jié)

重組藥物的質(zhì)量控制重組藥物與其它傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的藥品有許多不同之處，它利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，并具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)。它的生產(chǎn)涉及到生物材料和生物學(xué)過(guò)程，如：發(fā)酵、細(xì)胞培養(yǎng)、分離純化目的產(chǎn)物，這些過(guò)程有其固有的易變性。同時(shí)由于重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往在極微量下就可產(chǎn)生顯著效應(yīng)，任何藥物性質(zhì)或劑量上的偏差，都可能貽誤病情甚至造成嚴(yán)重危害。原材料質(zhì)量控制往往采用細(xì)胞學(xué)、表型鑒定、抗生素抗性檢測(cè)、限制性?xún)?nèi)切酶圖譜測(cè)定、序列分析與穩(wěn)定性監(jiān)控等方法。1.需明確目的基因的來(lái)源、克隆經(jīng)過(guò)，提供表達(dá)載體的名稱(chēng)、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分的來(lái)源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)志物等；一、原材料質(zhì)量控制

2.應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱(chēng)、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性等；

3.還需闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，如是否整合到染色體內(nèi)及在其中的拷貝數(shù)，并證明宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；4.提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過(guò)程中，啟動(dòng)與控制克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。在培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制上，要求種子克隆純而且穩(wěn)定，在培養(yǎng)過(guò)程中工程菌不應(yīng)出現(xiàn)突變或質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。生產(chǎn)重組藥物應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含致癌因子，無(wú)細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫(kù)。原始種子批需確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來(lái)源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用期，保存與復(fù)蘇時(shí)宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。對(duì)菌種最高允許的傳代次數(shù)、維持培養(yǎng)時(shí)間等也必須做詳細(xì)說(shuō)明。二、培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制在純化工藝過(guò)程的質(zhì)量控制上，要考慮到盡量去除污染病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白、糖及其它雜質(zhì)，并避免在純化過(guò)程帶入的有害物質(zhì)。如用柱層析技術(shù)應(yīng)提供所用填料的質(zhì)量認(rèn)證證明，并證實(shí)從柱上不會(huì)掉下有害物質(zhì)。上樣前應(yīng)清洗除去熱源等。純化工藝的每一步均應(yīng)測(cè)定純度，計(jì)算提純倍數(shù)、收率等。純化工藝過(guò)程中應(yīng)盡量不加入對(duì)人體有害的物質(zhì)，若不得不加時(shí)，應(yīng)設(shè)法除凈，并在最終產(chǎn)品中檢測(cè)殘余量，應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有害劑量，同時(shí)還要考慮到多次使用的積蓄作用。三、純化工藝過(guò)程的質(zhì)量控制

目前有許多方法可用于對(duì)重組技術(shù)所獲得蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行全面鑒定，如用各種電泳技術(shù)分析、高效液相色譜分析、肽圖分析、氨基酸成分分析、部分氨基酸序列分析及免疫學(xué)分析的方法等。四、對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制主要包括產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。

對(duì)其純度測(cè)定通常采用的方法有還原性及非還原性SDS、等電聚焦、各種HPLC、毛細(xì)管電泳等，需有兩種以上不同機(jī)制的分析方法相互佐證，以便對(duì)目的蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)；在其雜質(zhì)控制上要檢測(cè)內(nèi)毒素、熱原、宿主細(xì)胞蛋白、殘余DNA等。對(duì)其生物活性需采用國(guó)際或國(guó)家參考品，或經(jīng)過(guò)國(guó)家鑒定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的參比品，以體內(nèi)或細(xì)胞法測(cè)定制品的生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位；在安全性上需按照“中國(guó)生物制品規(guī)程”進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、毒性和安全試驗(yàn)。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，可能同時(shí)存在多種降解途徑，因此須在實(shí)際條件下長(zhǎng)期觀測(cè)穩(wěn)定性，對(duì)產(chǎn)品一致性、純度、分子特征和生物效價(jià)等多方面的變化情況加以綜合評(píng)價(jià)，確定產(chǎn)品的貯藏條件和使用期限等。第五節(jié)

典型重組藥物制造技術(shù)及工藝下面介紹幾種臨床上極為重要的重組藥物如干擾素、生長(zhǎng)素、胰島素等的生產(chǎn)技術(shù)及工藝。5.1重組人干擾素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.2重組人胰島素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.3重組人生長(zhǎng)素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.4重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.1重組人干擾素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.1.1重組人干擾素概述干擾素（interferon，IFN）是機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)細(xì)胞因子，是機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞通過(guò)抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類(lèi)似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。根據(jù)干擾素來(lái)源及其基因序列和氨基酸組成不同，可將干擾素分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型干擾素的表達(dá)細(xì)胞來(lái)源類(lèi)似，包括干擾素-α、β、ω、τ和λ。用病毒等刺激外周血漿樣樹(shù)突細(xì)胞（pDCs）可以產(chǎn)生干擾素-α、β、ω的13種亞型，3種干擾素-τ亞型和干擾素-λ，但是沒(méi)有Ⅱ型干擾素-γ。

干擾素的生物學(xué)活性相當(dāng)廣泛，主要包括廣譜抗病毒活性、直接抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性。1.干擾素抗病毒作用的特點(diǎn)是：①不能殺死病毒，只能抑制；②對(duì)病毒沒(méi)有直接的作用，通過(guò)細(xì)胞核內(nèi)的基因產(chǎn)生蛋白質(zhì)因子發(fā)揮作用，因此不同細(xì)胞對(duì)干擾素的敏感不同；③病毒大量復(fù)制時(shí)引發(fā)細(xì)胞炎癥應(yīng)答，此時(shí)易產(chǎn)生作用；④當(dāng)病毒DNA已整合到宿主細(xì)胞的染色質(zhì)中時(shí)，干擾素不能發(fā)揮其抗病毒活性。2.干擾素抗腫瘤作用：①直接抑制腫瘤細(xì)胞；②調(diào)節(jié)宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)；③改變宿主與腫瘤細(xì)胞的關(guān)系。3．干擾素的免疫調(diào)節(jié)活性①對(duì)免疫監(jiān)視系統(tǒng)②對(duì)免疫防衛(wèi)系統(tǒng)③對(duì)免疫自穩(wěn)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)干擾素的臨床應(yīng)用廣泛。干擾素在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用，在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂和免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性。（1）抗病毒干擾素-α/β能誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)多種肝炎病毒、鼻病毒、人乳頭瘤病毒、艾滋病病毒和多種RNA病毒產(chǎn)生抵抗力。（2）治療腫瘤干擾素是一種較理想的腫瘤抑制蛋白，它能調(diào)節(jié)正常的和惡性化的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。 （3）其它應(yīng)用有報(bào)道用干擾素治療精子缺乏癥、多發(fā)性硬化癥、黃斑變性癥等。5.1.2重組人干擾素生產(chǎn)技術(shù)和工藝重組人干擾素的生產(chǎn)主要包括工程菌的構(gòu)建、發(fā)酵、發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化及制劑加工等單元操作技術(shù)和工藝。一、工程菌的構(gòu)建（1）干擾素基因的克?。?）干擾素表達(dá)載體的構(gòu)建（3）基因工程菌應(yīng)具備的特性：①革蘭陰性，桿狀，長(zhǎng)度3～5μm。30℃培養(yǎng)24h，其菌落為2.5～3.0mm，灰綠色半透明狀，具有粘稠性。②不能將明膠、淀粉液化為可溶性單糖，不能利用進(jìn)行厭氧呼吸，能夠合成熒光色素。菌株為蘇氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，可以利用L-纈氨酸作為碳源。③遺傳特性DNA中G+C含量為63%。細(xì)胞中攜帶pVG3質(zhì)粒，具有硫酸鏈霉素、鹽酸四環(huán)素和氨芐青霉素的抗性。④放射性免疫學(xué)效價(jià)不能低于2.0×109IU/L。（4）菌種庫(kù)的建立及保存（5）工作菌種庫(kù)的建立及保存二、重組人干擾素-α2b的發(fā)酵工藝及過(guò)程控制生產(chǎn)菌種接種菌種活化種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵液降溫菌體搜集離心菌體冷凍保存蒸汽滅菌蒸汽滅菌配制培養(yǎng)基原料蒸汽滅菌1.發(fā)酵工藝過(guò)程2.發(fā)酵過(guò)程控制(1)假單胞桿菌的生長(zhǎng)和干擾素的生產(chǎn)基本處于不相關(guān)狀態(tài)。(2)一般的，種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分宜豐富些，尤其是氮源的含量應(yīng)較高（即C/N低）。(3)發(fā)酵要求培養(yǎng)液中有足夠的溶解氧，為了提高發(fā)酵罐的供養(yǎng)能力，往往需要增大攪拌轉(zhuǎn)速，增加空氣流量，或通入純氧。(4)假單胞桿菌你的生長(zhǎng)最適溫度與產(chǎn)物形成的最適溫度是不同的。穩(wěn)定而適中的溫度既能保證菌體細(xì)胞膜的完整和細(xì)胞中酶的催化活性，又有利于提高干擾素的產(chǎn)量。(5)pH值發(fā)酵過(guò)程中，pH的變化由工程菌的代謝、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件所決定。(6)隨著菌體繁殖，使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程形成過(guò)多和穩(wěn)定持久的泡沫?？刹捎脵C(jī)械攪拌和加入少量表面活性劑來(lái)消除泡沫。1.重組人干擾素-α2b的分離工藝過(guò)程：a.菌體裂解b.沉淀c.離心d.鹽析e.離心與儲(chǔ)存2.重組人干擾素-α2b純化工藝過(guò)程：

a.配制純化緩沖液b.溶解粗干擾素c.沉淀除雜質(zhì)d.離心e.疏水色譜f.沉淀g.超濾h.透析i.陰離子交換色譜j.濃縮和透析k.陰離子交換色譜l.濃縮m.凝膠過(guò)濾色譜n.無(wú)菌過(guò)濾分裝o.質(zhì)量控制3.重組人干擾素-α2b分離工藝控制：a.使用保護(hù)劑b.使用絮凝劑c.使用凝聚劑4.重組人干擾素-α2b的純化工藝控制：a.等電點(diǎn)沉淀b.膜分離c.疏水色譜d.離子交換色譜e.凝膠過(guò)濾色譜f.無(wú)菌灌裝三、分離純化工藝及過(guò)程控制干擾素的分離與純化分為兩個(gè)階段，初級(jí)分離階段和純化精制階段。整個(gè)分離純化過(guò)程的主要問(wèn)題是保證干擾素的活性。蛋白質(zhì)失活的機(jī)理概括起來(lái)有兩點(diǎn)。①一級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)的變化，造成失活。②如果一級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)被破壞，三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化也可能導(dǎo)致失活。蛋白質(zhì)活性損失的原因有很多，一般有以下的因素：溫度、流體狀態(tài)、摩擦、剪切力、吸附、截流、pH和介質(zhì)條件、溶解中氣體、微生物、活性抑制劑等。四、重組人干擾素的制劑類(lèi)型干擾素的劑型也在早期的注射劑的基礎(chǔ)上增加了鼻腔內(nèi)給藥系統(tǒng)、軟膏劑、栓劑、口含制劑、外用凝膠制劑、長(zhǎng)效制劑及緩釋制劑等。1.干擾素注射劑：干擾素的主要?jiǎng)┬蜑樽⑸鋭?，主要用于病毒感染性疾病和腫瘤的治療。2.長(zhǎng)效干擾素制劑：將聚乙二醇（PEG）分子結(jié)合到干擾素上，使其半衰期延長(zhǎng)，顯著增加了藥物在體內(nèi)保持活性狀態(tài)的時(shí)間，因而患者每周只需要注射一次即可。3.鼻腔內(nèi)給藥系統(tǒng)干擾素-α鼻腔內(nèi)給藥能抑制由鼻病毒引起的實(shí)驗(yàn)性感染，因此，可用于鼻病毒引起的呼吸系統(tǒng)感染。4.其它上市制劑：①栓劑②外用凝膠制劑③眼用制劑5.研發(fā)中的干擾素制劑①緩釋制劑②靶向制劑③口含制劑5.2重組人胰島素生產(chǎn)技術(shù)及工藝.5.2.1重組人胰島素概述胰島素（insulin）是多肽激素，由胰臟β細(xì)胞合成。成熟的胰島素由AB雙鏈組成，A鏈具有21個(gè)氨基酸殘基，B鏈具有30個(gè)氨基酸殘基，3對(duì)二硫鍵，2對(duì)鏈間二硫鍵，一對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵，胰島素的生理功能廣泛，能促進(jìn)糖原合成和糖酵解，產(chǎn)生ATP，降低血糖含量，保持能量供應(yīng)。缺乏胰島素時(shí)，導(dǎo)致人消瘦，高血糖和丙酮酸中毒，Ⅰ型糖尿?。╠iabetes）就是缺乏胰島素引起的。胰島素主要應(yīng)用于治療糖尿病，但長(zhǎng)期使用會(huì)引起腎和眼病。一系列的研究表明，重組人胰島素在結(jié)構(gòu)與功能上與天然胰島素均相同。在獲得臨床許可之前，人的臨床追蹤也發(fā)現(xiàn)重組胰島素在控制血糖水平方面與以前的胰島素產(chǎn)品一樣有效。5.2.2重組人胰島素生產(chǎn)技術(shù)及工藝重組人胰島素的生產(chǎn)主要采用兩種宿主表達(dá)系統(tǒng)，即大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)。一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組人胰島素大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)胰島素有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，一是表達(dá)量高，一般表達(dá)產(chǎn)物可以達(dá)到大腸桿菌總蛋白量的20%-30%；二是表達(dá)產(chǎn)物為不溶解的包含體，所以經(jīng)過(guò)水洗后表達(dá)產(chǎn)物的純度就可以達(dá)90%左右，因而易于下游純化。其缺點(diǎn)是表達(dá)出的胰島素尚沒(méi)有生物活性，需要變性和復(fù)性過(guò)程。二、酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組人胰島素 用酵母表達(dá)人胰島素的工藝優(yōu)點(diǎn)是，表達(dá)產(chǎn)物二硫鍵的結(jié)構(gòu)與位置正確，不需要復(fù)性加工處理。其缺點(diǎn)是表達(dá)量低，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)。三、重組人胰島素的質(zhì)量控制測(cè)定產(chǎn)品的生物活性和含量，控制產(chǎn)品中雜質(zhì)或潛在有害物質(zhì)，保證產(chǎn)品的安全性和有效性，胰島素在臨床上長(zhǎng)期重復(fù)使用，且劑量為毫克級(jí)，故必須考慮在生產(chǎn)過(guò)程中未除盡異種蛋白質(zhì)和自身降解產(chǎn)物潛在的危害性，鑒于胰島素產(chǎn)品上述特點(diǎn)，應(yīng)特別關(guān)注其有關(guān)雜質(zhì)。1.鑒別可用反相HPLC方法分析胰島素供試品和對(duì)照品，二者保留時(shí)間一致（相對(duì)保留時(shí)間為±2%）。2.效價(jià)測(cè)定現(xiàn)采用國(guó)際通用方法RP-HPLC測(cè)定效價(jià)，此法具有高專(zhuān)屬性，其結(jié)果與生物活性測(cè)定法一致。3.人胰島素原當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物為胰島素原融合蛋白，則需檢查原料中人胰島素原，常采用非放射性標(biāo)記方法，用生物素單抗和親和素酶標(biāo)記物方法，控制人胰島素原不得超過(guò)0.001%。常規(guī)胰島素注射液應(yīng)增加高分子蛋白檢查，其含量不超過(guò)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。5.3重組人生長(zhǎng)素生產(chǎn)技術(shù)及工藝.5.3.1重組人生長(zhǎng)素概述生長(zhǎng)素（growthhormone,GH,或somatotropin/Somatotrophin）是動(dòng)物腦垂體前葉外側(cè)的特異分泌細(xì)胞分泌的一種促進(jìn)生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)激素。生長(zhǎng)激素具有種屬特異性，人生長(zhǎng)激素（humangrowthhormone,hGH）為一鏈狀多肽的球形蛋白質(zhì)。目前重組人生長(zhǎng)激素已經(jīng)在許多國(guó)家廣泛使用，適應(yīng)癥主要有：①治療侏儒癥及兒童生長(zhǎng)素缺乏癥，在骨骼未閉合之前使用生長(zhǎng)激素，可以刺激骨骼端軟骨細(xì)胞分化，增殖，刺激軟骨基質(zhì)生長(zhǎng)，從而使身體長(zhǎng)高；②調(diào)節(jié)心腎功能，治療因慢性腎功能不全導(dǎo)致的生長(zhǎng)遲緩；③治療成人生長(zhǎng)素缺乏癥；④有助于術(shù)后的傷口愈合，臨床上用于治療燒傷，潰瘍及大手術(shù)后的傷口的治療；⑤用于延緩衰老，改善運(yùn)動(dòng)能力，可提高機(jī)體的免疫力。5.3.2重組人生長(zhǎng)素生產(chǎn)技術(shù)及工藝第一代重組人生長(zhǎng)激素是采用包含體技術(shù)生產(chǎn)的，含有甲硫氨酸，由192個(gè)氨基酸殘基組成。1.重組人生長(zhǎng)激素生產(chǎn)工藝流程與傳統(tǒng)的包含體技術(shù)相同，分泌型表達(dá)技術(shù)使生長(zhǎng)素以天然構(gòu)象直接分泌于菌體之外的培養(yǎng)液中，避免了重折疊，收率高，受菌體蛋白污染少，純度高，更安全。2.基因工程大腸桿菌發(fā)酵工藝種子培養(yǎng)過(guò)夜，然后進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間一般為16-18h,培養(yǎng)溫度為37℃，期間發(fā)酵液的pH值維持在7.0-7.5，溶解氧不能低于20%。另外在培養(yǎng)過(guò)程中需要添加葡萄糖及微量元素。3.重組人生長(zhǎng)激素分離工藝 4.重組人生長(zhǎng)激素純化工藝5.重組人生長(zhǎng)激素制劑質(zhì)量控制重組人生長(zhǎng)激素凍干制劑，含重組人生長(zhǎng)激素應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%-110.0%。大腸桿菌表達(dá)重組人生長(zhǎng)激素生產(chǎn)的工藝流程5.4重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.4.1促紅細(xì)胞生成素概述1.促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO），又稱(chēng)紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞生成刺激因子（erythropoietinstimulatingfactor，ESF），是調(diào)節(jié)紅系祖細(xì)胞，對(duì)紅細(xì)胞生成有特異性刺激作用的細(xì)胞因子。促紅細(xì)胞生成素是一種糖蛋白，在胎兒體內(nèi)由腎臟及肝臟產(chǎn)生，而在成人體內(nèi)主要由腎臟產(chǎn)生，占90%。腎功能受到損害，如慢性腎衰竭的患者，促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生受阻，可導(dǎo)致貧血。2、促紅細(xì)胞生成素的種類(lèi)(1)天然促紅細(xì)胞生成素：天然促紅細(xì)胞生成素是以人或動(dòng)物的尿、血等為材料，經(jīng)生化技術(shù)分離純化制備。(2)重組人促紅細(xì)胞生成素：重組人促紅細(xì)胞生成素是以基因工程技術(shù)生產(chǎn)的人促紅細(xì)胞生成素。3、促促紅細(xì)胞生成素的臨床應(yīng)用重組促紅細(xì)胞生成素是目前臨床上治療慢性腎衰性貧血療效最顯著的生物技術(shù)藥物。

5.4.2重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)技術(shù)及工藝（一）重組人促紅細(xì)胞生成素表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建：1、重組人促紅細(xì)胞生成素表達(dá)載體的構(gòu)建有兩種方式獲得編碼人促紅細(xì)胞生成素基因。一種是提取胎肝染色體DNA，然后以特異性寡核苷酸為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出人促紅細(xì)胞生成素的基因片段，體外拼接，然后與克隆載體連接?；蚴呛Y選