生物化學(xué)第2章Ⅱ核酸

一、一般物理性質(zhì)二、核酸的水解三、核酸的兩性性質(zhì)四、核酸的紫外吸收性質(zhì)五、變性、復(fù)性與雜交1、DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末狀固體，都微溶于水，其鈉鹽在水中的溶解度較大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有機(jī)溶劑。（用乙醇從溶液中沉淀核酸）2、DNA和RNA在細(xì)胞中常以核蛋白形式存在，兩種核蛋白在鹽溶液中的溶解度不同。DNA核蛋白R(shí)NA核蛋白0.14mol/LNaCl-+1-2mol/LNaCl+-一、一般物理性質(zhì)3、DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸發(fā)生變性或降解后其粘度降低。4、核酸受到強(qiáng)大離心力的作用時(shí)，可從溶液中沉降下來，其沉降速度與核酸的大小和密度有關(guān)。一、一般物理性質(zhì)1酸水解堿水解酶水解二、核酸的水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解1酸水解糖苷鍵和磷酸鍵都能被酸水解,糖苷鍵比磷酸鍵更容易

嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶的對(duì)酸更不穩(wěn)定,最不穩(wěn)定是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵二、核酸的水解2堿水解

DNA和RNA對(duì)堿的耐受程度有很大差別。室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解。

例如，室溫條件下，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA幾乎可以完全水解；DNA在同樣條件下則不受影響。但溫度100度時(shí)，4個(gè)小時(shí)也可得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。二、核酸的水解

二、核酸的水解3酶水解磷酸二酯酶:非特異水解磷酸二酯鍵核酸酶:特異水解核酸的磷酸二酯鍵

按底物分類:脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶

按底物作用的方式:核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶按磷酸二酯鍵斷裂方式:3’OH與磷酸間;5’OH與磷酸間其他分類:雙鏈酶,單鏈酶三、核酸的兩性性質(zhì)核酸含酸性的磷酸基團(tuán)，又含弱堿性的堿基，為兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性解離，核酸的等電點(diǎn)比較低（DNA的等電點(diǎn)為4-4.5，RNA的等電點(diǎn)為2-2.5(低)。（核酸在其等電點(diǎn)時(shí)溶解度最?。┖怂嵯喈?dāng)于多元酸，pH大時(shí)，呈陰離子狀態(tài)；---向陽(yáng)極遷移在核酸在260nm附近有最大吸收峰；據(jù)此特性可以定性和定量檢測(cè)核酸。蛋白質(zhì)在280nm有一定的吸收峰，因此利用D260/OD280比值可判斷核酸樣品的純度。四、紫外吸收減色效應(yīng)：核酸的光吸收值通常比各核苷酸成分的光吸收之和少30%-40%，這是有規(guī)律的雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基緊密堆積到一起造成的，此現(xiàn)象稱為DNA減色效應(yīng)。五、變性、復(fù)性與雜交（一）、DNA的變性1、概念2、變性因素3、變性的指標(biāo)1、概念是指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，雙螺旋解開，變成無規(guī)則線團(tuán)的現(xiàn)象。核酸變性其分子中的共價(jià)鍵并沒有破壞，分子量也不改變，核酸的變性（denaturation）2、DNA的變性的因素

溫度升高；酸堿度改變、pH（>11.3或<5.0）；有機(jī)溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等；各種射線低離子濃度3、DNA的變性指標(biāo)

1）熔解溫度（MeltingTemperature,Tm）：DNA熱變性發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變性過程中光吸收達(dá)到最大吸收（完全變性）一半（雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半）時(shí)的溫度稱為該DNA的熔點(diǎn)或熔解溫度。（一般DNA的Tm值在80-95

C之間）

Tm與下列因素有關(guān)：

核酸的均一程度，均一性越高的樣品，變性過程的溫度范圍越小。

Tm與G-C含量成正比。（（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44）

Tm與介質(zhì)離子強(qiáng)度成正比。mol/LKCl溫度/0CA2600.020.11.0

2）增色效應(yīng)：天然DNA分子從雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)閱捂湢顟B(tài)時(shí)，它在在紫外光260nm波長(zhǎng)處的吸收值明顯增加，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。1）熔解溫度（Tm）：RNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒有DNA那樣明顯。天然狀態(tài)的DNA在完全變性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%.而RNA變性后，約增加1.1%。A260值增加粘度下降浮力密度增大分子量不變4.DNA變性后的表現(xiàn)（二）、DNA的復(fù)性1、概念：變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性；DNA的復(fù)性圖示2、影響DNA的復(fù)性的因素分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。DNA的復(fù)性需要一定的鹽濃度，增加鹽濃度，復(fù)性速度加快將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。即淬火。但是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性，這一過程也叫退火（annealing)退火溫度＝Tm－25℃（三）、分子雜交熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定與同源DNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。

DNA單鏈與互補(bǔ)的RNA鏈之間也可以發(fā)生雜交。SouthernBlot：DNA-DNA雜交NorthernBlot：DNA-RNA雜交PCR技術(shù)核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。分子雜交的種類SouthernBlot：DNA-DNA雜交NorthernBlot：DNA-RNA雜交WesternBlot：抗原-抗體進(jìn)行雜交原位雜交：活體組織上進(jìn)行雜交，顯出熒光第一節(jié)概述第二節(jié)核酸的化學(xué)組成第三節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)第四節(jié)核酸的性質(zhì)

第五節(jié)核酸的研究方法第五節(jié)核酸的研究方法

一核酸的分離、提純和定量測(cè)定二核酸的凝膠電泳三序列測(cè)定四PCR五化學(xué)合成20.Tm與介質(zhì)離子強(qiáng)度成正比。NorthernBlot：DNA-RNA雜交(一)核酸的分離、提純傾去上清液并用200uL預(yù)冷乙醇（70%）清洗DNA沉淀，14000rpm離心5min；一核酸的分離、提純和定量測(cè)定14mol/LNaCl-+第五節(jié)核酸的研究方法SouthernBlot：DNA-DNA雜交按底物作用的方式:核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶0.DNA的凝膠電泳檢測(cè)(一)核酸的分離、提純其他分類:雙鏈酶,單鏈酶EB（溴化乙錠）;第五節(jié)核酸的研究方法一核酸的分離、提純和定量測(cè)定(一)核酸的分離、提純(二)定量測(cè)定第五節(jié)核酸的研究方法一核酸的分離、提純和定量測(cè)定

(一)核酸的分離、提純1、DNA2、RNA目前分離DNA方法：鹽抽提，用苯酚和氯仿去蛋白SDS/CTAB氯化銫密度梯度離心SDS法小量制備植物基因組DNA的原理

在含有去污劑，如SDS或CTAB的溶液中，植物細(xì)胞會(huì)被裂解釋放出細(xì)胞核中的基因組DNA，通過氯仿/異戊醇的抽提和離心去除掉裂解液中的細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)以及其它雜質(zhì)，這時(shí)的基因組DNA分配在水相中。然后用乙醇(或異丙醇)將水相的DNA分子沉淀出來，最后溶于TE緩沖液或純水中備用。剪取新鮮的植物葉片約20mg，剪碎置于1.5ml離心管中；向離心管中緩慢加入液氮冷凍植物葉片；在液氮蒸發(fā)去2/3時(shí)，用自制研杵迅速磨碎葉片；立即加入300uL65℃預(yù)熱的提取液搖勻，于65℃水浴約1hr，其間搖動(dòng)數(shù)次；加等體積氯仿/異戊醇（24:1）混勻，于12000rpm離心5分；轉(zhuǎn)移上清液到另一干凈1.5ml離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻后靜置2min，14000rpm離心5min；傾去上清液并用200uL預(yù)冷乙醇（70%）清洗DNA沉淀，14000rpm離心5min；用槍頭小心吸去乙醇，自然風(fēng)干DNA后溶于50uLddH2O中，置-20℃保存?zhèn)溆?。植物基因組DNA的小量快速制備方案

2、RNA注意：用高溫（180度）或DEPC處理加入RNasin第五節(jié)核酸的研究方法一核酸的分離、提純和定量測(cè)定(一)核酸的分離、提純

(二)定量測(cè)定(二)定量測(cè)定

紫外分光光度法定磷法定糖法

定磷法:磷含量相對(duì)恒定,(RNA9.4%;DNA9.9%)有機(jī)磷水解成無機(jī)磷用濃硫酸或過氯酸磷酸+鉬酸磷鉬酸酸性條件還原劑鉬藍(lán)660nm光密度與磷含量成正比定糖法

(核酸含糖)

糠醛+與甲基苯二酚(地衣酚)鮮綠色(最大670nm)RNA+鹽酸加熱糠醛FeCl3催化劑DNA酸性溶液+二苯胺加熱藍(lán)色化合物(最大595nm)第五節(jié)核酸的研究方法一核酸的分離、提純和定量測(cè)定

二核酸的凝膠電泳三序列測(cè)定四PCR五化學(xué)合成

二核酸的凝膠電泳

（一）瓊脂糖凝膠電泳（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳

DNA的凝膠電泳檢測(cè)

通常，瓊脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝膠被用于核酸的分離研究、鑒定和純化DNA分子。也可以用于蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究。瓊脂糖從紅色海藻瓊脂中提取的良好電泳介質(zhì)，是D-和L-半乳糖殘基通過

和

糖苷鍵交替構(gòu)成的一種線狀聚合物，瓊脂糖凝膠可以構(gòu)成一個(gè)直徑從50nm到略大于200nm的三維篩孔的通道。其密度由瓊脂糖的濃度決定。DNA的凝膠電泳檢測(cè)

（一）瓊脂糖凝膠電泳以瓊脂糖為支持物操作簡(jiǎn)單、快速，且分離范圍廣

DNA在瓊脂糖凝膠的遷移速度

1、核酸分子本身的大?。和肿拥哪Σ料禂?shù)成反比的2、瓊脂糖的濃度：遷移率與膠濃度成反比3、DNA的構(gòu)型：超螺旋（I）、環(huán)狀（II）、線狀（III）4、所用的電壓一般不大于5V/cm,一定范圍內(nèi)呈正比5、電泳緩沖液溴化乙錠(ethidiumbromide，簡(jiǎn)稱EB)是一種核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿基之間，并在300nm波長(zhǎng)的紫外光照射下放射出橘紅色的熒光，可用來顯現(xiàn)凝膠中的核酸分子。在凝膠電泳中，溴化乙錠染料可對(duì)核酸分子染色，在紫外光下便可以十分敏感而方便地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA譜帶。安全警示：EB是一種強(qiáng)的DNA誘變劑，使用時(shí)盡量避免觸及皮膚。電泳時(shí)有時(shí)使用到較高的電壓，要小心觸電。DNA的凝膠電泳檢測(cè)

DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

+-儀器電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、移液槍；藥品Agarose、loadingbuffer、TBEbuffer、EB（溴化乙錠）;上樣緩沖液（6X）配方0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯氰醇、40%蔗糖；水溶液4℃保存。不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度（％，W/V)DNA分子的有效分離范圍（kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2PCR擴(kuò)增結(jié)果分析舉例M1234567MM,marker;1-2,PCRforCP4-EPSPSgene;3-4,PCRfor35SPromoter;5-6,PCRforlectingene;7,Negtivecontrol.聚丙烯酰胺凝膠：在由TEMED(N、N、N`、N`-四甲基乙二胺)催化過硫酸胺還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線形長(zhǎng)鏈，在交聯(lián)劑N，N’-亞甲雙丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯酰胺的交聯(lián)鏈形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，鏈長(zhǎng)和交聯(lián)的程度就決定了凝膠的孔徑，同時(shí)也決定了分離DNA的能力。聚丙烯酰胺凝膠瓊脂糖凝膠制膠一般將EB直接加入而聚丙烯酰胺凝膠制膠時(shí)不能將染料加入，會(huì)影響聚合。<1000bp第五節(jié)核酸的研究方法一核酸的分離、提純和定量測(cè)定二核酸的凝膠電泳

三序列測(cè)定四化學(xué)合成五PCR三序列測(cè)定

1DNA酶法測(cè)序2DNA的化學(xué)法測(cè)序3RNA的測(cè)序

DNA酶法測(cè)序

Sanger

于1975年設(shè)計(jì)快速測(cè)序方法”加減法”轉(zhuǎn)移上清液到另一干凈1.（（G+C)%=(Tm-69.PCR擴(kuò)增結(jié)果分析舉例按底物作用的方式:核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶14mol/LNaCl-+4、核酸受到強(qiáng)大離心力的作用時(shí)，可從溶液中沉降下來，其沉降速度與核酸的大小和密度有關(guān)。第三節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)操作簡(jiǎn)單、快速，且分離范圍廣1-2mol/LNaCl+-4、所用的電壓一般不大于5V/cm,一定范圍注意：用高溫（180度）或DEPC處理也可以用于蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究。第二節(jié)核酸的化學(xué)組成DNA的復(fù)性需要一定的鹽濃度，增加鹽濃度，復(fù)性速度加快1）熔解溫度（MeltingTemperature,Tm）：DNA熱變性發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變性過程中光吸收達(dá)到最大吸收（完全變性）一半（雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半）時(shí)的溫度稱為該DNA的熔點(diǎn)或熔解溫度。通常，瓊脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝膠被用于核酸的分離研究、鑒定和純化DNA分子。70.按磷酸二酯鍵斷裂方式:3’OH與磷酸間;5’OH與磷1-2mol/LNaCl+-（（G+C)%=(Tm-69.14mol/LNaCl-+有機(jī)磷水解成無機(jī)磷14mol/LNaCl-+5，RNA的等電點(diǎn)為2-2.Tm與下列因素有關(guān)：氯化銫密度梯度離心第三節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)NorthernBlot：DNA-RNA雜交其他分類:雙鏈酶,單鏈酶14mol/LNaCl-+三序列測(cè)定

1DNA酶法測(cè)序

2DNA的化學(xué)法測(cè)序3RNA的測(cè)序

2DNA的化學(xué)法測(cè)序

Maxam和Gilbert于1977年發(fā)明基本原理:特異化學(xué)試劑作用與DNA分子中的不同堿基,然后切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈3RNA的測(cè)序第五節(jié)核酸的研究方法一核酸的分離、提純和定量測(cè)定二核酸的凝膠電泳三序列測(cè)定

四PCR五化學(xué)合成DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

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