臨床基因擴增檢驗實驗室的設置質量管理

臨床基因擴增檢驗實驗室的設置質量管理對相關管理文件的理解：臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準（第六條）臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范（第十條、第十三條、第十四條）臨床實驗室必須遵循的管理辦法及其它行業(yè)標準強調：污染的控制：預防為主質量保證污染的途徑：實驗材料試劑每一成分設備的每一部位每一操作步驟污染的判斷：經驗：全陽性，CT值>35；標準品的CT值發(fā)生波動陰性質控陽性陽性率異常增高輕微污染和非特異性擴增？污染和非特異性擴增:目的基因過程控制反應體系（引物、模版、酶、鎂離子、退火、循環(huán)）條件優(yōu)化控制的手段：工作區(qū)的嚴格劃分SOP的制訂和嚴格執(zhí)行去污染措施的常規(guī)采用“由于測定技術總是在發(fā)展之中，區(qū)域的合并應根據儀器的特點而定”質量手冊：闡明實驗室的質量方針，各方面質量管理的一般性描述第三個問題：達到目的的方法（途徑、手段）是什么？2周期校準：設備在投入使用后，每半年實施一次校準。測定RNA時cDNA的合成（注：75%乙醇配制時須用試劑盒中提供的DEPCH2O）。建立質量管理體系首先要解決的問題：關鍵：SOP和記錄的必要性和重要性6000rpm離心1分鐘，小心吸去上清，用75％的預冷乙醇（DEPC水配制）洗沉淀兩次。加人50μl血清標本或陰陽性標準品，再加人200μl的RNA提取液B充分混勻。1校準原理：采用移液槍吸蒸餾水稱重的方法校準；預定日期。標準操作程序（SOP文件）：是實驗室最為具體、最具有可操作性、也是使用頻率最高的文件關鍵：核心——過程（活動）PCR實驗室技術驗收對文件的要求：污染的監(jiān)測：陰性質控的設置：陰性血清樣本以水為模擬標本僅含擴增反應液（加鑒別實驗室是否污染的空白管)質控品的位置標準品－空白－陽性質控－陰性質控－臨床樣本標準品－空白－陽性質控－臨床樣本－陰性質控1按下表指示用量設定移液器移液體積……機械地抄書、說明書、其它實驗室的文件。1實驗室原則上應分為四個區(qū)，但如使1校準原理：采用移液槍吸蒸餾水稱重的方法校準；人員得到及時培訓。員必須經過培訓，并取得上崗證；2當抱怨或其它任何事項是對實驗室是否符合其現(xiàn)建立質量管理體系首先要解決的問題：實驗室各區(qū)的功能和配置：2實驗室應有培訓計劃和措施，保證其技術臨床基因擴增檢驗實驗室的設置質量管理1校準原理：采用移液槍吸蒸餾水稱重的方法校準；（b）報告的唯一性標識（如序號）；PCR實驗室技術驗收對文件的要求：建立質量管理體系首先要解決的問題：實驗室的設置管理要求：設置標準和工作規(guī)范具體落實：實事求是、因地制宜設置標準和工作規(guī)范

“原則上分為四個分隔的工作區(qū)；……各區(qū)必須有明確的標記……”“每一區(qū)域都須有專用的儀器……；不同的工作區(qū)應使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服……；離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出……”“……，可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價”“……，本區(qū)如采用副壓條件或減壓情況下可減少擴增產物從本區(qū)擴散至前區(qū)的可能性。理想的設置緩沖間緩沖間擴增區(qū)試劑準備區(qū)樣本制備區(qū)產物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間專用走廊工作流向磁性連鎖裝置現(xiàn)實的問題是：建筑結構通道、門水電供應采光、通風核酸擴增及產物分析檢測的操作程序；Finnpipette可調式移液器的校準方法員必須經過培訓，并取得上崗證；測定RNA時cDNA的合成1主要設備應有維護程序文件及維護記錄；實驗室各區(qū)的功能和配置：實驗室廢棄物的處理程序；人員素質：對文件的認知、熟悉、靈活運用程度主反應混合液制備成反應混合液SOP的制訂和嚴格執(zhí)行磁設備傳送結果時，實驗室應保證工作人員遵循文件化的實驗室各區(qū)的功能和配置：以管理措施彌補硬件的不足4實驗室應確定標本是否符合檢測要求,拒收標本基本的要求:四個區(qū)域必須是相互獨立的各區(qū)的儀器設備及各種物品必須是專用的各區(qū)間不能直通，應有緩沖間，供換工作服及鞋子用產物分析區(qū)應安裝排風扇或其它抽風裝置。擴增區(qū)試劑準備區(qū)樣本制備區(qū)產物檢測區(qū)其它實驗室走廊實例：其它實驗室樣本制備區(qū)擴增區(qū)試劑準備區(qū)產品檢測區(qū)走廊實例：實例：產物檢測區(qū)擴增區(qū)樣本制備區(qū)其它實驗室休息區(qū)試劑準備區(qū)擴增區(qū)產物檢測區(qū)走廊模板加樣區(qū)實例：樣本處理區(qū)實例：小結：處理原則的核心是通過合理的設置解決好臨床PCR檢測實際運作動態(tài)過程中可能發(fā)生的污染的預防問題因此，實驗室的設計必須充分考慮到對污染來源和污染途徑的預防和控制實驗室各區(qū)的功能和配置：試劑儲存和準備區(qū)儲存試劑的制備試劑的分裝主反應混合液的制備冰箱混勻器微量加樣器可移動紫外燈專用工作服和工作鞋消耗品（帶濾心吸頭、離心管、一次性手套等）專用辦公用品等。標本制備區(qū)：臨床標本的保存核酸提取、儲存及其加入至擴增反應管測定RNA時cDNA的合成不得在本區(qū)對樣本進行PCR擴增冰箱(2~8℃和-20℃或-80℃)高速臺式冷凍離心機水浴箱和/或加熱模塊生物安全柜混勻器微量加樣器可移動紫外燈專用工作服和工作鞋專用消耗品專用辦公用品等擴增區(qū)：DNA或cDNA擴增已制備的DNA模板和合成的cDNA的加入主反應混合液制備成反應混合液如果空間允許的話，模板的加入也可以在一個獨立的空間內完成核酸擴增儀微量加樣器(視情況定)可移動紫外燈專用工作服和工作鞋專用消耗品專用辦公用品等產物分析區(qū)：擴增片段的測定最主要的擴增產物污染來源有可能使用致突變和有毒物質微量加樣器可移動紫外燈專用工作服和工作鞋專用消耗品專用辦公用品等輔助用房：清潔區(qū)標本接受區(qū)：靈活設置不干擾四區(qū)規(guī)范的保存和傳遞實驗室使用和管理：標本接受區(qū)樣本制備區(qū)擴增區(qū)產物分析區(qū)試劑準備區(qū)區(qū)域的適當合并：

“由于測定技術總是在發(fā)展之中，區(qū)域的合并應根據儀器的特點而定”小結：從核心儀器特點、實驗室的現(xiàn)狀出發(fā)，綜合考慮管理要求盡可能在現(xiàn)有條件下滿足管理要求以管理措施彌補硬件的不足有條件，留有余地再好的分區(qū)設置，如果不輔之與認真執(zhí)行的相應的管理制度，等同于無。實驗室質量體系的建立：管理要求體系建立管理要求：1實驗室設置和設備1.1實驗室原則上應分為四個區(qū)，但如使用全自動擴增檢測儀，區(qū)域可適當合并。1.2各工作區(qū)的明確標記1.3實驗室設置應能有效地防止PCR后區(qū)產物的污染。

……管理要求：2設施和環(huán)境2.1實驗室的設施、工作區(qū)域、能源、照明、溫控、通風等。應便于檢測工作的正常進行。2.2實驗室應配備溫度濕度計、穩(wěn)壓電源等。2.3進入和使用實驗室各區(qū)域應有明確的限制和控制。2.4應有實驗室清潔、消毒制度及相應用具；2.5實驗室應有有關生物污染物處理、生物防護等措施及相應用具；管理要求：3人員3.1實驗室應配備足夠數量的人員；這些人員必須經過培訓，并取得上崗證；3.2實驗室應有培訓計劃和措施，保證其技術人員得到及時培訓。3.3實驗室應保存其技術人員有關資格證書（如上崗證）、培訓、技能和經歷等技術檔案。管理要求：4設備管理4.1主要設備應有維護程序文件及維護記錄；4.2(a)有問題的設備應立即停止使用，并加上明顯標識，如可能應將其貯存在規(guī)定的地方直至修復；(b)修復的設備必須經校準、檢定（驗證）或檢測滿足要求后方能再次投入使用；(c)實驗室應檢查由于上述缺陷對以前所進行的檢測工作的影響。4.3加樣器、溫度計、擴增儀和酶標儀等應有校準程序并進行校準，擴增儀和酶標儀應有明顯的標識表明其校準狀態(tài)。4.4應保存擴增儀、酶標儀、生物安全柜、加樣器等設備的檔案管理要求：5檢測方法5.1實驗室應制定：

有關儀器設備操作程序；

有關擴增檢測的工作程序。5.2所有上述標準操作程序都應現(xiàn)行有效并便于工作人員使用。5.3實驗室應有儀器、試劑、消耗品的選購、驗收、貯存和質檢程序；必須使用經國家有關部門批準的試劑和儀器。管理要求：6標本管理6.1實驗室應建立對擬檢測標本的唯一編號識別系統(tǒng)。6.2實驗室應制定有關標本收集、處理、運送、貯存程序。6.3在接收標本時應有其狀態(tài)的詳細記錄。6.4實驗室應確定標本是否符合檢測要求,拒收標本原因要明確。6.5如果標本必須在特定的環(huán)境條件下（如2-8℃、

-20℃和-70℃低溫）貯存，則應對這些條件加以維持、監(jiān)控和記錄；管理要求：7記錄7.1實驗室應有適合自身實際情況又符合現(xiàn)行規(guī)章制度的記錄管理制度；7.2記錄應有參與標本收集、標本準備和處理、檢測的人員簽字。7.3所有記錄和報告都應安全貯存、妥善保管并保密。管理要求：8報告8.1檢測結果的報告應準確、清晰和客觀。定性測定報告“陰性”或“陽性”；定量測定則以拷貝數/ml或IU/ml報告。8.2每份報告應包括以下信息：（a）標題，例如“檢測報告”（b）報告的唯一性標識（如序號）；（c）檢測標本的特性和狀態(tài)；（d）檢測標本的接收時間和進行檢測的時間；（f）采用的檢測方法；（g）實驗操作及校核人員的簽字，以及簽發(fā)日期；（h）檢測報告中應給出參考結果或范圍；8.3當報告的有效性發(fā)生疑問時，實驗室應立即通知臨床相關科室予以改正。8.4當臨床科室或患者要求用、圖文或其它電子和電磁設備傳送結果時，實驗室應保證工作人員遵循文件化的程序，并為對方保密。管理要求：9質量控制9.1實驗室應有室內質量控制標準操作程序文件：（a）質控物的合理性；（b）質控方法（圖）的有效性；（c）失控的判斷；（d）失控的措施。9.2實驗室應參加室間質量評價管理要求：10抱怨10.1實驗室應制定抱怨及其處理的標準操作程序；應將抱怨資料及處理抱怨所采取的措施及結果記錄歸檔保存。10.2當抱怨或其它任何事項是對實驗室是否符合其現(xiàn)行程序、或者是否符合《臨床基因擴增實驗室管理暫行辦法》和《臨床基因擴增實驗室工作規(guī)范》、或是對其它有關實驗室校準或檢測質量提出疑問時，則實驗室應立即對這些范圍的工作和有關職責進行審核。管理要求（現(xiàn)場考核）：送審的文件描述與實驗室實際情況的一致性實際運行與文件規(guī)定的一致性人員素質：對文件的認知、熟悉、靈活運用程度現(xiàn)場考核的實際內涵：認識到不到位落實到不到位符合性檢查加指導性檢查有重點的全面檢查建立質量管理體系首先要解決的問題：第一個問題：質量體系建立的核心問題是什么？第二個問題：質量體系模式要達到的管理目的是什么？第三個問題：達到目的的方法（途徑、手段）是什么？質量體系的定義

為實施質量管理所需的組織結構、程序、過程和資源。要點：定義涵蓋了實驗室管理的每一個方面。

具有專業(yè)知識的人，按文件就能順利完成實驗各區(qū)的儀器設備及各種物品必須是專用的員必須經過培訓，并取得上崗證；3加樣器、溫度計、擴增儀和酶標儀等應有校準程序并進行“……，本區(qū)如采用副壓條件或減壓情況下可減少擴增產物從本區(qū)擴散至前區(qū)的可能性。標準品的CT值發(fā)生波動3在接收標本時應有其狀態(tài)的詳細記錄。加人50μl血清標本或陰陽性標準品，再加人200μl的RNA提取液B充分混勻。輕微污染和非特異性擴增？以及簽發(fā)日期；3在接收標本時應有其狀態(tài)的詳細記錄。SOP等同于以往的操作卡或操作說明書申請表的附錄5“需準備的標準操作程序（最低要求）”程序文件和SOP的關系3實驗室應有儀器、試劑、消耗品的選購、組織結構：一個組織為行使其職能，按某種方式建立的職責、權限及其相互關系。程序：為進行某項活動所規(guī)定的途徑。過程：將輸入轉化為輸出的一組彼此相關的資源和活動。四個組成部分的關系：關鍵：核心——過程（活動）紐帶——程序

組織結構程序

資源過程理解“過程”的重要性

1、工作是通過過程來完成的。

2、質量管理是通過對各種過程的控制來實現(xiàn)的。

3、質量管理本身也是一系列的過程過程的分解、控制過程的有機組合過程前處理檢測樣本采集和接受編制報告審核報告發(fā)放記錄保存登記編號質控咨詢質量體系運行的目的方針目標質量環(huán)及要素QS結構QS文件QS運行QS審核QS評審質量改進報告證書主要手段：質量體系文件質量方針：質量手冊：闡明實驗室的質量方針，各方面質量管理的一般性描述程序性文件：對通用于整個實驗室的某些方面工作的文件化描述標準操作程序（SOP文件）：是實驗室最為具體、最具有可操作性、也是使用頻率最高的文件PCR實驗室技術驗收對文件的要求：儀器設備的維護保養(yǎng)程序；儀器設備的校準程序；儀器設備的操作程序；臨床標本的收集程序；臨床標本的處理（核酸純化）程序；臨床標本的保存程序；核酸擴增及產物分析檢測的操作程序；試劑的質檢操作程序；實驗室消耗品購買、驗收和貯存程序；實驗室廢棄物的處理程序；實驗室的清潔程序；室內質量控制程序；抱怨處理程序。申請表的附錄5“需準備的標準操作程序（最低要求）”對實驗室的質量手冊和程序文件沒作要求對必須具備的SOP文件的編撰格式沒作具體要求SOP：實驗室最具個性的文件不夠嚴謹準確不夠連貫不夠嚴密例：用加樣槍取100μl樣品加入提取液用加樣器（移液器）以前進式移液法吸取100μl樣品加入提取液例：

向一新的經高壓滅菌處理過的離心管中加入10μl充分混勻的RNA提取液A（RNA提取液A易沉淀，取樣前需用移液器反復吸打混勻后吸?。?。加人50μl血清標本或陰陽性標準品，再加人200μl的RNA提取液B充分混勻。室溫放置5分鐘。6000rpm離心1分鐘，小心吸去上清，用75％的預冷乙醇（DEPC水配制）洗沉淀兩次。（取75％乙醇450μl洗沉淀，充分震蕩混勻，6000rpm，離心1分鐘，然后去上清，再用75％的乙醇450μl洗一次），65℃干燥沉淀10分鐘。（注：75%乙醇配制時須用試劑盒中提供的DEPCH2O）。

機械地抄書、說明書、其它實驗室的文件。撰寫SOP文件要做到：具有專業(yè)知識的人，按文件就能順利完成實驗忠實而且連貫地反映實驗過程對文件表述的理解無歧義嚴謹、嚴密準確和簡練文件的文字組織：簡練明確向一新的經高壓滅菌處理過的離心管中加入10μl充分混勻的RNA提取液A（RNA提取液A易沉淀，取樣前需用移液器反復吸打混勻后吸取）。加人50μl血清標本或陰陽性標準品，再加人200μl的RNA提取液B充分混勻。室溫放置5分鐘。6000rpm離心1分鐘，小心吸去上清，用75％的預冷乙醇（DEPC水配制）洗沉淀兩次。（取75％乙醇450μl洗沉淀，充分震蕩混勻，6000rpm，離心1分鐘，然后去上清，再用75％的乙醇450μl洗一次），65℃干燥沉淀10分鐘。（注：75%乙醇配制時須用試劑盒中提供的DEPCH2O）。質量體系文件的構成：

質量手冊程序性文件質量文件

質量文件（作業(yè)指導書、表格、報告等）程序文件和SOP的關系對通用于整個實驗室的某些方面工作的文件化描述具體操作的標準化文件程序文件等同于以往的管理制度SOP等同于以往的操作卡或操作說明書WhatWhoWhereWhenWhyHow寫合乎管理要求的，寫你做得到的難點：寫你所做的做你所寫的記錄你所做的關鍵：SOP和記錄的必要性和重要性儀器設備的校準程序目的：保證檢驗的有效性，準確性。范圍：本程序適用于滿足PCR實驗室檢測需要并可能對檢驗結果造成誤差的儀器設備。主要有：……職責：校準由PCR實驗室主任負責組織執(zhí)行。工作流程：4.1校準方法：……Finpipette可調式移液器校準采用廠家推薦方法。校準主要使用設備為BS110S電子天平（）?！?.2校準計劃：4.2.1啟用校準：設備在投入使用時實施啟用校準。4.2.2周期校準：設備在投入使用后，每半年實施一次校準。4.2.3維修后校準：設備在維修后須經校準方可重新投入使用。4.2.4校準計劃外的校準：如在檢測及EQA，IQC活動中發(fā)現(xiàn)存在結果漂移或偏差及其它可疑情況時，通過分析對可疑設備實施校準。4.2.5Finpipette可調式移液器的校準順序：按照單一流向規(guī)定，對Finpipette可調式移液器的校準首先校準試劑準備區(qū)，然后依次為樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)。每校準完一個區(qū)的移