化學品 哺乳動物精原細胞染色體畸變試驗方法 征求意見稿

1GB/T21751—2024化學品哺乳動物精原細胞染色體畸變試驗方法本文件規(guī)定了化學品哺乳動物精原細胞染色體畸變試驗的范圍、術(shù)語和定義、試驗基本原則、試驗方法和程序、數(shù)據(jù)與報告。本文件適用于測試化學品對哺乳動物精原細胞的細胞遺傳學毒性。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1染色單體型畸變chromatid-typeaberration表現(xiàn)為單個染色單體斷裂或染色單體間斷裂和重接的染色體結(jié)構(gòu)損傷。3.2染色體型畸變chromosome-typeaberration表現(xiàn)為兩個染色單體在相同位點斷裂或斷裂和重接的染色體結(jié)構(gòu)損傷。3.3裂隙gap小于染色單體寬度的不著色的損傷，并伴有染色單體極小的錯位。3.4數(shù)目畸變numericalaberration染色體數(shù)目改變，不同于所有動物染色體的正常數(shù)目。3.5結(jié)構(gòu)畸變structuralaberration通過顯微鏡可觀察到的發(fā)生在細胞分化中期的染色體結(jié)構(gòu)改變，鏡下可見如缺失、碎片、內(nèi)交換或互換。3.6非整倍性aneuploidy指一個或多個染色體與正常的二倍體(或單倍體)染色體數(shù)目的偏差，但不包括整組染色體(多倍體)。3.7多倍體polyploidy單倍體染色體（n）數(shù)目，但不包括二倍體數(shù)目（即3n,4n等）。3.8著絲粒centromere2GB/T21751—2024染色體上的一個區(qū)域，在細胞分裂時與紡錘體纖維相連，使子妹染色體能有序地運動到子細胞的兩3.9染色體多樣性chromosomediversity染色體形狀(如metacentrique,acrocentriques等)和大小的多樣性。3.10染色體斷裂劑clastogen在細胞群或生物體中引起染色體結(jié)構(gòu)畸變的任何物質(zhì)。3.11基因毒性genetoxic包括所有類型的DNA或染色體損傷的總稱，包括斷裂、缺失、加合、核苷酸修飾和連接、重排、突變、染色體畸變和非整倍體。并不是所有類型的基因毒性效應都會導致突變或穩(wěn)定的染色體損傷。3.12有絲分裂指數(shù)mitoticindex,MI在細胞群中觀察到的中期分裂相細胞數(shù)除以總細胞數(shù)的比值;這是細胞群體增殖程度的標志。3.13有絲分裂mitosis細胞核的分裂，通常分為前期、前中期、中期、后期和末期。3.14致突變mutagenic產(chǎn)生基因中DNA堿基對序列或染色體結(jié)構(gòu)(染色體畸變)的可遺傳變化。4試驗方法4.1試驗基本原則動物通過適當?shù)谋┞锻緩浇佑|受試化學品，并在染毒后的適當時間實施安樂死。在安樂死之前，用細胞分裂中期相阻斷劑(如秋水仙堿或秋水酰胺)處理動物，然后制備精原細胞染色體標本并染色，分析中期分裂相細胞的染色體畸變。4.2實驗室能力的驗證本試驗的能力驗證應通過陽性對照物質(zhì)(包括弱反應)處理的精原細胞重現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)畸變頻率的預期結(jié)果以及獲得與已經(jīng)發(fā)表的文獻中對照數(shù)據(jù)可接受范圍一致的陰性對照頻率，或者與實驗室歷史對照一致的數(shù)據(jù)來建立。4.3實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境4.3.1動物物種選擇3GB/T21751—2024通常采用健康的年輕的成年動物，常用實驗室品系。常用雄性小鼠。但在科學合理的情況下，可以使用其他合適的雄性哺乳動物，并允許該試驗與另一個試驗一起進行。應在報告中提供使用嚙齒動物以外的物種的科學理由。4.3.2動物房和飼養(yǎng)條件對于嚙齒動物，動物房合適的溫度應為22℃±3℃。相對濕度最好為50%-60%，但至少為40%。除房間清洗時外，最好不超過70%。人工照明12h亮12h暗。喂飼常規(guī)的實驗室飼料，不限量供應飲用水。如果采用喂飼染毒法，應根據(jù)需要選擇飼料，以確保受試化學品在其中均勻地混合。如果嚙齒動物沒有攻擊性行為，則應同籠飼養(yǎng)(每籠不超過5只)，最好是在有堅固地面的籠內(nèi)飼養(yǎng)并有適當?shù)沫h(huán)境豐榮。如果科學合理，動物可以單獨飼養(yǎng)。4.3.3動物準備通常使用健康的年輕的成年雄性動物(染毒開始時8-12周齡)，并隨機分配到對照組和染毒組。每只動物都采用一種人道的、微創(chuàng)的方法進行識別（如打標簽、微芯片或生物特征識別，但不能剪耳朵或腳趾）。在試驗開始前，動物應至少5天提前適應實驗室環(huán)境。應盡量減少籠子布置方式而可能產(chǎn)生的影響。應避免陽性對照與受試化學品交叉污染。在試驗開始時，動物個體之間體重差異應最小，不超過±20%。4.3.4受試物準備在給動物染毒之前，固體受試化學品應溶解或懸浮在適當?shù)娜軇┗蛸x形劑中，或混合在飼料或飲用水中。液體受試化學品可以直接染毒或稀釋后染毒。對于吸入暴露，可以根據(jù)受試化學品的物理化學性質(zhì)，以氣體、蒸汽或固體/液體氣溶膠的形式進行染毒。除非穩(wěn)定性數(shù)據(jù)證明可以貯存并說明適當?shù)膬Υ鏃l件，否則應使用新配制的受試化學品。4.4試驗條件4.4.1溶劑和賦形劑在采用的劑量水平下，溶劑/賦形劑不應產(chǎn)生毒性作用，且不應與受試物質(zhì)發(fā)生化學反應。如果使用的不是熟知的溶劑/賦形劑，則應提供參考數(shù)據(jù)說明其適用性。建議只要條件允許，應該首先考慮使用水做溶劑/賦形劑。常用的溶劑/賦形劑包括水、生理鹽水、甲基纖維素溶液、羧甲基纖維素鈉鹽溶液、橄欖油和玉米油。在沒有歷史數(shù)據(jù)或已發(fā)表的對照數(shù)據(jù)表明所選擇的非典型溶劑/賦形劑不會導致染色體結(jié)構(gòu)畸變和其他有害影響的情況下，應進行初步研究，以確定這種溶劑/賦形劑對照的可接受性。4.4.2陽性對照應始終同時設置陽性對照動物，除非實驗室已證明能夠熟練進行試驗，并在最近(例如在最近5年內(nèi))經(jīng)常進行該試驗。當沒有同時設置的陽性對照組時，每次實驗應包括評分對照組(固定的和未染色的玻片)，這些可以通過在評分中納入適當?shù)膮⒖紭颖緛慝@得。參考樣本可以是定期(例如，每6-18個月)在實4GB/T21751—2024驗室進行的單獨陽性對照實驗中獲得和存儲的。例如，在實驗室能力測試期間和此后定期的試驗基礎上獲得。陽性對照物質(zhì)應能夠可靠地產(chǎn)生可被檢測的高于自發(fā)水平的細胞染色體結(jié)構(gòu)畸變頻率。陽性對照劑量設置應能產(chǎn)生明顯效應，但不要使讀片者一看即知為陽性對照片。陽性對照物的舉例列于表1。表1陽性對照物的舉例MitomycinC4.4.3陰性對照每次試驗應該設置陰性對照組，除了使用溶劑或賦形劑處理外，其他處理方式與染毒組相同。在沒有歷史數(shù)據(jù)或已發(fā)表的對照數(shù)據(jù)表明所選溶劑/賦形劑不會導致染色體畸變或其他有害影響的情況下，為了確定賦形劑對照的可接受性，在每個采樣時間也應納入未處理的對照組動物。4.5操作步驟4.5.1動物數(shù)量試驗開始時每組應至少包括5只雄性動物。每組動物的數(shù)量應足以提供足夠的統(tǒng)計效能(即，在顯著性水平為0.05的情況下，當陰性對照水平為1.0%或更高時，通常有80%概率能夠檢測到至少加倍的染色體畸變頻率。如果一個研究包括兩個采樣時間，三個染毒劑量組和一個陰性對照組，一個陽性對照組(每組包括5只動物)，將需要45只動物。4.5.2染毒程序受試化學品通常一次染毒(即單一處理)。如果有科學依據(jù)，可以采用其他劑量方案。最高劑量組染毒后應分兩次采樣。由于受試物攝取和代謝所需的時間，以及其對細胞周期動力學的影響，會影響染色體畸變檢測的最佳時間，因此應在染毒后約24h和48h前后分別進行一次早采樣和一次晚采樣。除最高劑量組外的其他劑量組，應該在染毒后24h(小于或等于B型精原細胞的細胞周期5GB/T21751—2024時間，從而優(yōu)化第一次染毒后的中期分裂相評分)進行，除非有更適當?shù)牧硪粋€采樣時間。也可以使用其他采樣時間。例如，對于具有S期獨立效應的化學品，可能需要更早的取樣時間(即小于24h)。可采用重復劑量染毒方案，如與另一個試驗終點聯(lián)合使用28天給藥期，但需要額外的動物組來適應不同的采樣時間。因此，這種時間計劃表的適當性需要在個案基礎上科學地加以證明。在動物安樂死之前，腹腔注射適當劑量的中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水酰胺）。此后在合適的時間間隔采樣。對于大鼠和小鼠，時間間隔大約是3~5h。4.5.3劑量水平如果沒有合適的實驗數(shù)據(jù)可以幫助劑量選擇，應該在同一實驗室使用相同的種屬、品系以及相同的處理方式進行初步的劑量范圍研究。本研究應旨在確定最大耐受劑量(MTD)，其定義為研究期間的持續(xù)表現(xiàn)(例如異常行為或反應、輕微體重下降或造血系統(tǒng)細胞毒性)，但不包括導致死亡或具有疼痛的證據(jù)，使動物遭受痛苦或不得不安樂死的輕微毒性作用的劑量。最高劑量也可定義為在精原細胞中產(chǎn)生某種毒性的劑量(例如，精原細胞有絲分裂中期相與第一次和第二次減數(shù)分裂中期相的比例降低，但這個降幅不應超過50%)。在較低的無毒性劑量下對具有特定生物活性的化學品(如激素和促細胞分裂劑)，以及對表現(xiàn)出毒物動力學特性飽和的物質(zhì)進行試驗，可以不采用上述劑量標準，這應根據(jù)具體情況進行評估。為了獲得劑量反應信息，一項完整的研究應包括一個陰性對照組和最少三個劑量組，通常以2倍但不超過4倍間隔。如果在劑量組距研究中或根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，該受試化學品不產(chǎn)生毒性，單次染毒的最高劑量應為2000mg/kgbw。但是，如果受試化學品確實導致毒性，則給予的最高劑量應是MTD，所使用的劑量水平最好涵蓋從最高劑量到產(chǎn)生很少或無毒性的劑量范圍。當靶組織(即睪丸)在所有劑量水平下觀察到毒性時，建議在無毒性劑量下進一步研究，那些旨在更全面地描述定量的劑量-反應信息的研究可能需要額外的劑量組。對于有特定要求的某些類型的受試化學品(如人用藥品)，這些限制不同。如果受試化學品確實產(chǎn)生毒性，則應選擇限度劑量加上兩個較低劑量。給藥14天及以上的限度劑量為1000mg/kgbw/day，給藥14天以下的限度劑量為2000mg/kgbw/day。4.5.4藥物給藥在設計試驗時應考慮預期的人類接觸途徑。因此，飲食、飲用水、局部皮下注射、靜脈注射、口服(灌胃)、吸入或植入等暴露途徑可能是合理的選擇。在任何情況下，應選擇適當?shù)耐緩揭源_保靶組織充分暴露。通常不推薦腹腔注射，因為它通常不是一個生理上常見的人類暴露途徑，除非有科學證明。如果受試化學品混在飼料或飲水中，尤其是單次給藥時，應該注意食物和水消耗之間的延遲，應充分采樣保證檢測到毒性效應。一次灌胃或注射的最大液體體積取決于實驗動物的大小。通常體積不應該超過1mL/100gbw，如果是水溶液最大體積不超過2mL/100gbw。如果動物福利允許，給藥體積超過這個限度應該論證。應通過調(diào)整濃度來盡量減少受試物體積的變化，以確保在所有劑量水平下的體積與體重保持恒定。4.5.5觀察應對試驗動物進行一般臨床觀察，最好每天同一時間至少記錄一次臨床體征，并考慮給藥后預期效果出現(xiàn)的高峰期。每天至少兩次，應觀察所有動物的發(fā)病率和死亡率。所有動物都應該在試驗開始時稱重，在重復劑量試驗期間至少每周一次，并在安樂死時稱重。在至少持續(xù)一周的試驗中，應至少每周測6GB/T21751—2024量食物消耗量。如果受試化學品是通過飲用水給藥的，則應在每次換水時和至少每周測量用水量。表現(xiàn)出非致死指征毒性過量的動物應在試驗結(jié)束前實施安樂死。4.5.6染色體制備在動物安樂死之后，立即取單側(cè)或兩側(cè)睪丸制備細胞懸液，經(jīng)低滲溶液處理和固定后，平鋪細胞于載玻片上進行染色。玻片應該編碼以便進行盲評。4.5.7分析對每只動物至少計分200個分散良好的中期分裂相細胞。如果歷史陰性對照頻率<1%，應對超過200個細胞/動物進行評分，以增加統(tǒng)計效能。應使用能夠識別著絲粒的染色方法。應分別記錄染色體和染色單體型畸變，并按亞型(斷裂、交換)分類。在檢測一個化學品是否會顯著增加細胞染色體畸變的發(fā)生率時，應記錄裂隙。應確保由訓練有素的評分員進行染色體畸變分析?？紤]到玻片制備過程通常會導致一定比例的中期相斷裂，從而導致染色體丟失，因此，被標記的細胞應該包含不少于2n±2的著絲粒，其中n是該種屬的染色體單倍體數(shù)。雖然試驗目的是檢測染色體結(jié)構(gòu)畸變，但如果有，也應該記錄多倍體細胞和染色體重復復制的細胞頻率。5數(shù)據(jù)和結(jié)果5.1結(jié)果處理每個實驗動物數(shù)據(jù)應以表格形式提供。對于每只動物，應評估具有染色體結(jié)構(gòu)畸變的細胞數(shù)和每個細胞的染色體畸變數(shù)。實驗組和對照組應分別列出按亞型(斷裂、交換)分類的染色體型和染色單體型畸變的數(shù)量和頻率。裂隙及其頻率應單獨記錄和報告，但一般不包括在總的畸變頻率中。如果觀察到多倍體和染色體重復復制的細胞，應該記錄其比例。應該報告毒性和臨床表現(xiàn)數(shù)據(jù)。5.2驗收標準下列標準決定試驗的可靠性：a).同期陰性對照與歷史陰性對照數(shù)據(jù)的公開標準一致，細胞畸變率通常在0%~1.5%之間。b).同期陽性對照引起的反應與歷史陽性對照數(shù)據(jù)或?qū)嶒炇覛v史陽性對照數(shù)據(jù)庫(如果有)的已公開標準一致，并與陰性對照相比產(chǎn)生統(tǒng)計學顯著增加。c).分析足夠的細胞數(shù)和劑量組。d).最高劑量的選擇標準與上述描述一致。如果同時觀察到有絲分裂和減數(shù)分裂，應檢測精原細胞有絲分裂與第一個和第二個減數(shù)分裂中期相的比率，作為衡量所有染毒組和陰性對照組的每個動物各100個分裂細胞的細胞毒性的一個指標。如果只觀察到有絲分裂，則每只動物至少要檢測1000個細胞的有絲分裂指數(shù)。5.3結(jié)果的評價和解釋7GB/T21751—2024應至少分析三個染毒劑量組，以便為劑量-反應分析提供足夠的數(shù)據(jù)。在滿足所有可接受標準的情況下，如果有以下情況，則認為受試物是明顯陽性的：a).與同期陰性對照相比，至少一種試驗劑量組顯示出有統(tǒng)計學意義的增加；b).至少在一個采樣時間內(nèi)具有與劑量相關的增加;c).如有任何超出陰性對照組數(shù)據(jù)的可接受范圍的結(jié)果，或超出實驗室歷史陰性對照數(shù)據(jù)的分布(如泊松95%對照限度)。然后認為受試化學物質(zhì)能夠誘導實驗動物精原細胞的染色體畸變。如果滿足了所有的可接受標準，如果有以下情況，則認為受試物是明顯的陰性：a).與同期陰性對照相比，所有試驗劑量均無統(tǒng)計學意義的增加;b).在任何實驗條件下，沒有劑量相關的增加；c).如有，所有結(jié)果均在陰性對照數(shù)據(jù)或?qū)嶒炇覛v史陰性對照數(shù)據(jù)(如泊松95%對照限度)的可接受范圍內(nèi)。然后認為受試化學物質(zhì)不能誘導實驗動物精原細胞的染色體畸變。陰性結(jié)果并不排除這種化學物在未研究的發(fā)育后期誘發(fā)染色體畸變或基因突變的可能性。對明確的陽性或陰性結(jié)果沒有必要進行驗證。如果反應不是明確的陽性或陰性的，為了幫助建立一個生物學相關性結(jié)果(例如微弱或邊緣性的增加)，應該通過專家判斷和/或使用現(xiàn)有的實驗數(shù)據(jù)進行進一步的調(diào)查來評估數(shù)據(jù)，例如考慮陽性結(jié)果是否超出陰性對照數(shù)據(jù)或?qū)嶒炇业臍v史陰性對照數(shù)據(jù)的可接受范圍。在極少數(shù)情況下，即使經(jīng)過進一步的調(diào)查，從數(shù)據(jù)集也無法做出陽性或陰性結(jié)果的結(jié)論，因此結(jié)論就是是模棱兩可的。多倍體細胞數(shù)量的增加可能表明受試化學品具有抑制有絲分裂過程和誘導染色體畸變的潛力。染色體重復復制的細胞數(shù)量的增加可能表明受試化學品有抑制細胞周期進程的潛力。誘導染色體數(shù)量變化的機制與抑制有絲分裂過程的機制是不同的。因此，應分別記錄多倍體細胞和有重復復制染色體的細胞的發(fā)生率。6試驗報告試驗報告應該包括如下信息：6.1總結(jié)6.2受試化學品6.2.1一般資料a)來源、批號、使用期限(如有);b)受試化學品本身的穩(wěn)定性(如已知);c)受試化學品在溶劑中的溶解度和穩(wěn)定性（如已知）;d)pH值、滲透壓、添加受試化學品的培養(yǎng)基中沉淀物。6.2.2單一成分化學物8GB/T21751—2024a)物理外觀、水中溶解度及其他相關的理化性質(zhì)；b)化學識別號，如IUPAC或CAS名稱、CAS編號、SMILES或InChI代碼、結(jié)構(gòu)式、純度、雜質(zhì)的化學鑒定等；c)多組分物質(zhì)，UVBCs和混合物;d)盡可能通過化學特性來表征的各組分，定量的和相關的理化性質(zhì)。6.2.3受試化學品的制備a)選擇賦形劑的理由;b)受試化學品在溶劑/賦形劑中的溶解度和穩(wěn)定性;c)飼料、飲用水或吸入配方的制備;d)對配方進行分析測定(如穩(wěn)定性、均勻性、標稱濃度)。6.3試驗動物a)使用的品種/品系及使用的理由;b)動物的數(shù)量和年齡;c)來源、飼養(yǎng)條件、飲食等;d)唯一識別動物的方法e)對于短期試驗：試驗開始和結(jié)束時的動物個體體重:對于超過一周的試驗：試驗期間的個體體重和食物消耗量。應包括各組體重范圍、平均值和標準差。6.4試驗條件和結(jié)果——陽性對照和陰性對照(溶劑/賦形劑)數(shù)據(jù);——進行劑量組距試驗所得的數(shù)據(jù);——選擇劑量水平的依據(jù);——給藥途徑的依據(jù);——受試化學品制備的詳細描述;——受試化學品染毒的詳細描述;——處死時間的依據(jù);——檢測動物毒性的方法（如有應包括