化妝品原料祛斑美白功效評價試驗方法（征求意見稿）編制說明

1T/LNPCXXX-2024化妝品原料祛斑美白功效評價試驗方法本文件規(guī)定了基于體外人皮膚模型的化妝品原料的祛斑美白功效試驗方法。本文件適用于具有生物學祛斑美白作用的化妝品原料祛斑美白功效試驗。本文件可作為化妝品原料祛斑美白功效試驗方法之一，對化妝品原料祛斑美白功效進行評價。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理黑素細胞位于表皮的基底層，細胞內(nèi)的黑素小體能合成黑色素，并轉(zhuǎn)移到周圍的角質(zhì)形成細胞，賦予皮膚顏色。皮膚中黑色素的數(shù)量決定了皮膚的顏色。黑素細胞刺激激素(α-MSH）可刺激黑素細胞合成和分泌黑色素，通過酶標儀測定OD值可檢測黑色素的分泌量。本文件檢測加入受試樣品后黑素細胞中黑素分泌量的變化，進而反映化妝品原料是否對皮膚有祛斑美白功效。5儀器及設(shè)備5.1生物安全柜。5.2倒置顯微鏡。5.3CO2培養(yǎng)箱：37℃,95%相對濕度、5%CO2/空氣。5.4低溫高速離心機。5.5酶標儀：450nm、630nm。5.6分析天平：精度0.1mg。5.7微量移液器：5000μL、1000μL、200μL、20μL。6試劑和耗材6.1黑素細胞（B16細胞）。6.2DMEM細胞培養(yǎng)基。6.30.25%胰蛋白酶（無菌）。6.4PBS磷酸鹽緩沖液（無菌）。6.5α-MSH7試驗步驟7.1體外模型的準備2T/LNPCXXX-20247.1.1細胞培養(yǎng)將黑素細胞用胰蛋白酶作用5min-10min后，用專用培養(yǎng)基終止消化，巴氏吸管吹打細胞使其成為單細胞懸液。加入適量培養(yǎng)基稀釋細胞懸液使其密度約為1×104個/mL。用微量移液器吸取細胞懸液以200μL/孔接種到96孔板中，然后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。7.1.2α-MSH刺激待細胞生長到融合度為85%-90%左右時，用微量移液器吸干96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，加入10nMα-MSH刺激3h，空白對照組不作α-MSH刺激處理。7.2給予化妝品原料試驗設(shè)置空白對照組、α-MSH-對照組和化妝品原料組。稱取一定量的化妝品原料，將其用DMEM培養(yǎng)基稀釋到試驗濃度。用微量移液器吸干96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基。空白對照組、刺激對照組每孔僅加入200μL培養(yǎng)基，化妝品原料組每孔加入200μL含有化妝品原料的培養(yǎng)基。隨后將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h。7.3樣品收集轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液至新的96孔板中，用酶標儀檢測黑色素的分泌量。7.4測定條件在405nm波長測定吸光度，計算黑色素相對分泌量。8結(jié)果計算A試MRS=A試A對式中：MRS：黑色素相對分泌量，%；A試：化妝品原料組吸光度；A對：刺激對照組吸光度。9結(jié)果判定全部符合以下條件說明化妝品原料具有祛斑美白功效:1、與空白對照組相比，α-MSH對照組黑色素相對含量大于100%，且具有顯著性差異（p＜0.05）。2、與α-MSH對照組相比，化妝品原料組黑色素含量減少，且具有顯著性差異（p＜0.05）。3T/LNPCXXX-2024參考文獻[1]國家藥品監(jiān)督管