微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)乳酸菌的分離與純化

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)乳酸菌的分離與純化三、實(shí)驗(yàn)器材：菌種來(lái)源：市場(chǎng)銷售的各種新鮮酸乳培養(yǎng)基：BGC牛乳培養(yǎng)基乳酸菌培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基糖發(fā)酵培養(yǎng)基BGC牛乳培養(yǎng)基（A）溶液：脫脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚綠(B.G.C)乙醇溶液1mL,80℃滅菌20min。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，瓊脂20g，pH6.8,121℃滅菌20min。以無(wú)菌操作趁熱將（A）、（B）溶液混合均勻后倒平板。乳酸菌培養(yǎng)基牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，乳糖5g，氯化鈉5g，水1000mL，pH：6.8；1.6%溴甲酚綠蛋白胨水培養(yǎng)基蛋白胨10g，氯化鈉5g，水1000mL，pH：7.2~7.4糖發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2mL，pH：7.6，另配20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各10mL。制法：1）將上述含指示劑的蛋白胨水培養(yǎng)基（pH：7.6）分裝于試管中，在每管內(nèi)放一倒置的小玻璃管。2）將已分裝好的蛋白胨水培養(yǎng)基和20%的各種糖溶液分別滅菌，蛋白胨水培養(yǎng)基121℃滅菌20min，糖溶液112℃滅菌30min。3)滅菌后，每管以無(wú)菌操作分別加入20%的糖溶液0.5mL，則成1%的濃度。有關(guān)溶液：1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫1.6g溶于100mL乙醇中，貯存于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩＿胚嵩噭簩?duì)二甲基氨基苯甲醛8g，95%乙醇760mL，濃鹽酸160mL。10%硫酸2%高錳酸鉀含氨的硝酸鹽溶液：稱取硝酸銀2g，蒸餾水100mL，待硝酸銀溶解后，取出10mL備用，向其余的90mL硝酸銀中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，繼續(xù)滴加氨水至沉淀剛剛?cè)芙獬蔀槌吻迦芤簽橹?，再將備用的硝酸銀慢慢滴入，則溶液出現(xiàn)薄霧，但輕輕搖動(dòng)后，薄霧狀的沉淀又消失，繼續(xù)滴入硝酸銀，直到搖動(dòng)后仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止。四、操作步驟：（一）乳酸菌的分離純化

1.稀釋分離培養(yǎng)基的配制滅菌倒平板制備樣品稀釋液接種（涂布法）培養(yǎng)每組準(zhǔn)備下列器材（滅菌）

1.培養(yǎng)基A溶液（250ml三角瓶，內(nèi)裝125ml）2.培養(yǎng)基B溶液（250ml三角瓶，內(nèi)裝125ml）3.試管7支（內(nèi)裝9ml水）4.培養(yǎng)皿一包（9個(gè)）5.1ml刻度吸管7支2mL，分別接入BGC牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上，用無(wú)菌玻璃刮刀依次涂布，置40℃培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變黃者初步定為乳酸菌。（A）溶液：脫脂乳粉100g，水500mL，加入1.也證明此菌種不是大腸桿菌，因?yàn)槿绻谴竽c桿菌除了產(chǎn)酸反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性外，而且杜氏小管內(nèi)會(huì)有氣泡，因?yàn)榇竽c桿菌具有分解葡萄糖和蔗糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣的能力。每組準(zhǔn)備下列器材（滅菌）（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，瓊脂20g，pH6.（一）乳酸菌的分離純化如果培養(yǎng)液呈黃色，反映結(jié)果為陽(yáng)性。在吲哚試驗(yàn)中，加入菌種的試管無(wú)任何變化，證明為陰性反應(yīng)培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽(yáng)性反應(yīng)，杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)。在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，在加入葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，且杜氏小管內(nèi)無(wú)氣泡挑取單菌落平板劃線，置40℃培養(yǎng)48h。6）分裝于試管中，在每管內(nèi)放一倒置的小玻璃管。以無(wú)菌操作趁熱將（A）、（B）溶液混合均勻后倒平板。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，瓊脂20g，pH6.也說(shuō)明此菌種不是大腸桿菌，因?yàn)榇竽c桿菌的吲哚試驗(yàn)證明為陽(yáng)性。

1mL瓊脂培養(yǎng)基每管各9mL無(wú)菌水

取市售新鮮酸乳稀釋至10-6，取其中的10-4、10-5、

10-63個(gè)稀釋度的稀釋液各0.2mL，分別接入BGC牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上，用無(wú)菌玻璃刮刀依次涂布，置40℃培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變黃者初步定為乳酸菌。2.劃線分離挑取單菌落平板劃線，置40℃培養(yǎng)48h。挑選出乳酸菌進(jìn)行連續(xù)6次以上的傳代，以達(dá)到提純。（二）鑒別1吲哚試驗(yàn)1）試管標(biāo)記：取裝有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管n+1支，分別標(biāo)記乳酸菌和空白對(duì)照。2）接種培養(yǎng)：以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔到標(biāo)記乳酸菌的試管中，標(biāo)記有空白對(duì)照的不接種，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。3）觀察記錄：在培養(yǎng)基中加入乙醚1~2mL，經(jīng)充分振蕩，使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢加入5~10滴吲哚試劑，如有吲哚存在，乙醚層呈玫瑰色，此為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。2.糖發(fā)酵試驗(yàn)1）試管標(biāo)記：取分別裝有葡萄糖，蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各n+1支，每種糖發(fā)酵試管中分別標(biāo)記乳酸菌和空白對(duì)照。2）接種培養(yǎng)：以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液的空白對(duì)照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置試管中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。（一）乳酸菌的分離純化挑選出乳酸菌進(jìn)行連續(xù)6次以上的傳代，以達(dá)到提純。加入蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后的反應(yīng)結(jié)果也為陽(yáng)性且杜氏小管內(nèi)無(wú)氣泡也證明此菌種不是大腸桿菌，因?yàn)槿绻谴竽c桿菌除了產(chǎn)酸反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性外，而且杜氏小管內(nèi)會(huì)有氣泡，因?yàn)榇竽c桿菌具有分解葡萄糖和蔗糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣的能力。6）分裝于試管中，在每管內(nèi)放一倒置的小玻璃管。2mL，分別接入BGC牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上，用無(wú)菌玻璃刮刀依次涂布，置40℃培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變黃者初步定為乳酸菌。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，瓊脂20g，pH6.（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，瓊脂20g，pH6.培養(yǎng)基的配制滅菌倒平板在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，在加入葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，且杜氏小管內(nèi)無(wú)氣泡在吲哚試驗(yàn)中，加入菌種的試管無(wú)任何變化，證明為陰性反應(yīng)如果培養(yǎng)液呈黃色，反映結(jié)果為陽(yáng)性。每組準(zhǔn)備下列器材（滅菌）如果培養(yǎng)液呈黃色，反映結(jié)果為陽(yáng)性。8,121℃滅菌20min。3）觀察記錄：與對(duì)照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原由顏色，其反映結(jié)果為陰性；如果培養(yǎng)液呈黃色，反映結(jié)果為陽(yáng)性。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽(yáng)性反應(yīng)，杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)。3.乳酸的檢測(cè)選用已經(jīng)分離的菌種做小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，取發(fā)酵液的上清液約10mL于試管中，加入10%硫酸1mL，再加2%高錳酸鉀1mL，此時(shí)乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛，把事先在含氨的硝酸銀溶液中侵泡的濾紙條搭在試管口中，微火加熱試管至沸，觀察濾紙變化。五、結(jié)果分析1.乳酸菌的分離提純?cè)谄桨迳铣霈F(xiàn)了圓形稍扁平的黃色菌落，周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，初步定為乳酸菌⑴，取出少量在顯微鏡下觀察到了鏈球狀和桿狀兩種形狀。2.乳酸菌的鑒定該菌種的菌落為圓形稍扁平的黃色菌落，有桿狀和鏈球狀兩種形狀。在吲哚試驗(yàn)中，加入菌種的試管無(wú)任何變化，證明為陰性反應(yīng)說(shuō)明該菌不具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力。也說(shuō)明此菌種不是大腸桿菌，因?yàn)榇竽c桿菌的吲哚試驗(yàn)證明為陽(yáng)性。在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，在加入葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，且杜氏小管內(nèi)無(wú)氣泡加入蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后的反應(yīng)結(jié)果也為陽(yáng)性且杜氏小管內(nèi)無(wú)氣泡在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，在加入葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，且杜氏小管內(nèi)無(wú)氣泡選用已經(jīng)分離的菌種做小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，取發(fā)酵液的上清液約10mL于試管中，加入10%硫酸1mL，再加2%高錳酸鉀1mL，此時(shí)乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛，把事先在含氨的硝酸銀溶液中侵泡的濾紙條搭在試管口中，微火加熱試管至沸，觀察濾紙變化。在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，在加入葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，且杜氏小管內(nèi)無(wú)氣泡也證明此菌種不是大腸桿菌，因?yàn)槿绻谴竽c桿菌除了產(chǎn)酸反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性外，而且杜氏小管內(nèi)會(huì)有氣泡，因?yàn)榇竽c桿菌具有分解葡萄糖和蔗糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣的能力。6）分裝于試管中，在每管內(nèi)放一倒置的小玻璃管。C)乙醇溶液1mL,80℃滅菌20min。也證明此菌種不是大腸桿菌，因?yàn)槿绻谴竽c桿菌除了產(chǎn)酸反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性外，而且杜氏小管內(nèi)會(huì)有氣泡，因?yàn)榇竽c桿菌具有分解葡萄糖和蔗糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣的能力。C)乙醇溶液1mL,80℃滅菌20min。證明該菌種能分解葡萄糖和蔗糖而產(chǎn)酸。蛋白胨水培養(yǎng)基1000mL，1.挑選出乳酸菌進(jìn)行連續(xù)6次以上的傳代，以達(dá)到提純。8,121℃滅菌20min。（一）乳酸菌的分離純化6g溶于1