2025屆高考生物一輪復習新考案-大單元11生物技術與工程微難點5pcr相關問題分析(人教版2019)

微難點5PCR相關問題分析核心提煉1．PCR過程模型圖形顯示一輪循環(huán)產生的子鏈長度小于互補鏈的長度，只有第三輪循環(huán)時，才會合成出2個兩條脫氧核苷酸鏈等長的子代DNA，即第n輪循環(huán)，合成等長的DNA分子數為2n－2n。2．引物的歸類分析(1)DNA的復制需要引物的原因：DNA聚合酶只能催化脫氧核糖核苷酸加至已有單鏈的游離3′－羥基上，而不能使脫氧核糖核苷酸自身發(fā)生聚合。①引物是一小段單鏈DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基互補配對。②細胞內DNA復制以RNA作引物，它的合成是由一種特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的。③PCR反應一般以DNA作引物(因為RNA易降解)。(2)設計引物的主要原則①引物長度應大于16個核苷酸(通常為20～30個核苷酸)，可防止隨機結合。②引物與靶序列間的Tm(DNA熔解溫度)不應過低。③引物不應有發(fā)夾結構，即不能有4bp以上的回文序列。④2個引物間不應有4bp以上的互補序列或同源序列，在3′端不應有任何互補的堿基。⑤引物中堿基的分布盡可能均勻，G＋C含量接近50%。(3)引物的處理由于引物延伸從3′端開始，3′端不能進行任何修飾，引物5′端對擴增特異性影響不大。有時需要使經PCR擴增的目的基因能與載體正常結合，需要在2種引物的5′端添加不同的限制酶的識別序列，保證目的基因定向插入載體并可避免目的基因自身環(huán)化。(4)引物的選擇和互補鏈的判斷DNA聚合酶只能特異性地復制處于2個引物之間的DNA序列，引物5′端的堿基與DNA母鏈3′端的堿基進行堿基互補配對，可作為DNA復制的起始點，DNA子鏈的合成方向是從引物開始由5′端向3′端延伸。3．PCR技術中的數量關系物質(復制)1次2次3次n次DNA分子數2482n含引物的DNA分子數2482n含引物A(或B)的DNA分子數1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同時含引物A、B的DNA分子數0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗的引物(A和B)數量2＝22－26＝23－214＝24－22n+1－2兩條單鏈等長的DNA分子數0＝21－20＝22－42＝23－62n－2nDNA分子種類2455舉題固法考向1PCR的過程與引物設計(2021·江蘇卷)某小組為研究真菌基因m的功能，構建了融合表達蛋白M和tag標簽的質粒。請結合實驗流程回答下列問題：(1)目的基因的擴增①提取真菌細胞__RNA__，經逆轉錄獲得cDNA，進一步獲得基因m片段。②為了獲得融合tag標簽的蛋白M，設計引物P2時，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導致__蛋白M上不含tag標簽__。③熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是先將除TaqDNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加熱到80℃以上再混入酶，然后直接從94℃開始PCR擴增。下列敘述正確的有__BC__。A．Taq酶最適催化溫度范圍為50～60℃B．與常規(guī)PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物C．兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸D．PCR產物DNA堿基序列的特異性體現了Taq酶的特異性(2)重組質粒的構建①將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進__黏性末端堿基配對__，形成A－m結合體。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及__DNA連接__酶等，完成質粒的環(huán)化。②若正確構建的重組質粒A－m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在__基因m的連接處、基因m的內部__。(3)融合蛋白的表達①用含有尿嘧啶的培養(yǎng)基培養(yǎng)URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導入質粒A－m，然后涂布于無尿嘧啶的培養(yǎng)基上，篩選獲得目的菌株，其機理是__受體菌在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上無法生長，導入重組質粒的受體菌含有URA3基因，可以長成菌落__。②若通過抗原—抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，說明__融合基因表達(或融合基因正確解碼)__，后續(xù)實驗可借助tag標簽進行蛋白M的分離純化。解析：(1)①以逆轉錄獲得cDNA的方式，要先從真菌細胞中提取基因m轉錄出來的mRNA。②從構建好的重組質粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的轉錄產物mRNA上有終止密碼子，核糖體移動到終止密碼子時多肽鏈就斷開，則不會對tag序列的轉錄產物繼續(xù)進行翻譯，蛋白M上就不含tag標簽。③Taq酶在延伸階段發(fā)揮作用，最適催化溫度范圍為72℃左右，A錯誤；PCR反應的最初加熱過程中，樣品溫度上升到70℃之前，在較低的溫度下引物可能與部分單鏈模板形成非特異性結合，并在TaqDNA聚合酶的作用下延伸，結果會導致引物錯配形成的產物的擴增，影響反應的特異性，熱啟動可減少引物錯配形成的產物擴增，提高反應的特異性，B正確；DNA分子復制具有方向性，都是從5′端向3′端延伸，C正確；Taq酶對堿基序列沒有特異性，與普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高溫，D錯誤。(2)①從圖上看，載體A只有一個SmaⅠ的酶切位點，故被SmaⅠ切開后，載體由環(huán)狀變?yōu)殒湢頓NA，將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進載體A與添加同源序列的m的黏性末端堿基互補配對。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及DNA連接酶等，完成質粒的環(huán)化。②重組質粒中，載體A被SmaⅠ切開的位置已經與基因m相連，原來的酶切位點已不存在，若正確構建的重組質粒A－m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在基因m的連接處或基因m內部。(3)①篩選目的菌株的機理是導入了質粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上存活，而URA3基因缺失型酵母則不能存活。②若通過抗原—抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，位于tag標簽上游的基因m應該正常表達，說明融合基因表達(或融合基因正確解碼)。審答指導流程圖的解題步驟：①搞清圖例或特別說明；②根據單箭頭分析流程的變化；③了解每個特殊步驟的文字說明的目的或指向；④小題干的小情境中，尋找填空處前后的邏輯關系；⑤沒有明顯邏輯關系的，則需要從流程圖中尋找答案。(2020·江蘇卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如下圖所示(以EcoRⅠ酶切為例)。請據圖回答問題：(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種__限制性內切核酸(或限制)__酶，它通過識別特定的__核苷酸序列__切割特定位點。(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成__磷酸二酯鍵__；PCR循環(huán)中，升溫到95℃是為了獲得__DNA單鏈__；TaqDNA聚合酶的作用是催化__以DNA為模板的DNA鏈的延伸__。(3)若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是__②④__(從引物①②③④中選擇，填編號)。DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(4)對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結果正確的是__B__。A．5′－AACTATGCG…AGCCCTT－3′B．5′－AATTCCATG…CTGAATT－3′C．5′－GCAATGCGT…TCGGGAA－3′D．5′－TTGATACGC…CGAGTAC－3′解析：DNA連接酶是在相鄰的核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。引物與對應的模板鏈能夠堿基互補，且方向相反，步驟Ⅲ需要擴增出片段F的完整序列，需要包括已知序列兩端的未知序列，所以需要引物②(其3′端與環(huán)狀DNA內鏈已知序列的5′端互補)和④(其3′與環(huán)狀DNA外鏈已知序列的5′端互補)。觀察圖知，片段F兩側均有EcoRⅠ切割后的末端，EcoRⅠ的識別序列是G↓AATTC，所以F片段一條鏈的5′端開始肯定是AATTC，只有B符合。審答指導引物的選擇或設計類問題的解決(1)一定要知道的原則：引物延伸的方向是不變的，子鏈一定從5′端向3′端延伸。(2)具體操作：①沿著引物的方向確定模板DNA；②確定引物延伸得到的目標DNA；③找到引物與模板DNA的結合位置；④引物一定是模板鏈的互補鏈，且方向一定是從5′端→3′端?？枷?PCR技術中的數量關系(2011·江蘇卷節(jié)選)請回答基因工程方面的有關問題：(1)利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似(見下圖)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。①理論上推測，第四輪循環(huán)產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為__15/16__。②在第__三__輪循環(huán)產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。(2)設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(見下圖)，請分別說明理由。①第1組：__引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效__；②第2組：__引物Ⅰ′自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效__。(3)PCR反應體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因為__DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結合到雙鏈DNA片段的引物鏈上__。解析：(1)①由圖可知，由原來的每條母鏈為模板合成的兩個新DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子鏈為模板合成新DNA分子時，兩種引物都含有，故第四輪循環(huán)共產生16個DNA分子，其中含有引物A的分子是15個，占15/16。②PCR過程需引物，畫出反應過程如下圖所示：由圖示可知，第一、二輪循環(huán)合成的DNA的兩條鏈長度均不同，第三輪循環(huán)產生的DNA分子存在等長的兩條核苷酸鏈。(2)在第1組引物中，引物Ⅰ的部分堿基序列是－CAGGCT－，引物Ⅱ的部分堿基序列是－AGCCTG－，若利用這兩個引物進行DNA擴增，會因其中的這部分堿基發(fā)生堿基互補配對而使引物失效。在第2組引物中，引物Ⅰ′的部分堿基序列是－AACTG－和－CAGTT－，該引物一旦發(fā)生自身折疊，也將會出現部分堿基互補配對而使引物失效。(3)圖中直接將兩個脫氧核苷酸合成DNA單鏈，這不能反映DNA聚合酶的功能，因為DNA聚合酶只能在DNA模板存在的條件下，將單個脫氧核苷酸連續(xù)結合到DNA片段的引物鏈上?？枷?新情境下PCR技術(2023·常州期末)重疊延伸PCR技術是常規(guī)PCR技術的衍生，它依據需要連接的基因中核苷酸序列(或基因片段)設計出多對具有互補末端的引物，先分段對模板進行擴增，再將PCR產物混合，其中的重疊鏈將相互搭橋、互為模板而延伸，最終實現不同來源的擴增片段重疊拼接起來的目的，如圖1所示。請分析并回答下列問題：圖1圖2(1)圖1中的過程②在__2__個反應體系中進行，原因是__引物互補影響PCR結果__。經過程②后，體系中存在不同長度的DNA片段，獲取所需DNA的方法是__(瓊脂糖凝膠)電泳分離__。①中引物2和引物3的游離部分分別與__外顯子B、外顯子A__的部分序列同源。(2)圖1中的過程⑥__不需要__(選填“需要”或“不需要”)另加引物，原因是__兩條DNA的交錯部分即可作為其延伸的引物__。進行②⑥⑧⑩過程時，需要在一定的緩沖溶液中進行，⑩過程除圖示條件還需要加入__原料(四種脫氧核苷酸)、耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)__。(3)重疊延伸PCR技術可用于基因的定點突變?；蚨c突變是根據目的基因(如圖2蛋白A基因)的序列，設計4條單鏈寡核苷酸片段為引物(圖2中的引物A→D)，原理是取引物A、B進行PCR1反應，以及引物C、D進行PCR2反應，然后將需要的兩個片段混合、延伸并大量擴增。圖2引物B和引物C中的“”代表__突變堿基__，引物B和引物C堿基序列間存在的關系是__互補__。解析：(1)過程②中的引物2和引物3會發(fā)生部分互補，需要2個反應體系。分離不同長度的PCR產物，可通過瓊脂糖凝膠電泳進行。由圖1可知，①中引物2和引物3的游離部分分別與外顯子B、外顯子A的部分序列同源。(2)由于引物2有一部分與外顯子A重疊，另一部分與外顯子B重疊，可作為其延伸的引物，所以圖1中的過程⑥不需要另加引物。②⑥⑧⑩為PCR過程，除了圖中的引物、模板、緩沖液外，還需要添加四種脫氧核苷酸和TaqDNA聚合酶。(3)基因定點突變是根據目的基因的序列，使基因上的某堿基缺失、增添或替換，故圖2引物B和引物C中的“∧”代表突變堿基。分析圖2可知，引物B和引物C堿基序列間存在互補關系。eq\o(\s\up7(),\s\do5(\a\vs4\al(綜合微生物培養(yǎng)或PCR的基因工程,問題)))(2023·江蘇卷)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術構建質粒，如圖1所示。請回答下列問題：eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖1))(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有__模板、引物__，擴增程序中最主要的不同是__退火溫度__。(2)有關基因序列如圖2。引物F2－F、F1－R應在下列選項中選用__CD__。eq\o(\s\up7(EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC…GACGAGCTGTACAAG3′,AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG…CCAAAACCACAACCA3′),\s\do25(圖2))A．ATGGTG…CAACCAB．TGGTTG…CACCATC．GACGAG…CTGCAGD．CTGCAG…CTCGTC(3)將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質粒，直接用于轉化細菌。這一過程與傳統重組質粒構建過程相比，無需使用的酶主要有__限制酶、DNA連接酶__。(4)轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯誤的有__ABC__。A．稀釋涂布平板需控制每個平板30～300個菌落B．抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高C．抗性平板上常常會出現大量雜菌形成的菌落D．抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化(5)為了驗證平板上菌落中的質粒是否符合設計，用不同菌落的質粒為模板，用引物F1－F和F2－R進行了PCR擴增，質粒P1～P4的擴增產物電泳結果如圖3。根據圖中結果判斷，可以舍棄的質粒有__P3、P4__。圖3(6)對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是__電泳只能測定DNA長度，不能確定堿基序列__。解析：本題主要考查基因工程的相關知識。(1)PCR反應進行的條件包括引物、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2+)等。分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有模板(片段F1、片段F2)和引物。PCR過程包括變性、復性和延伸三個階段，通過溫度的變化進行控制，由于引物和模板存在差異，擴增程序中最主要的不同是退火溫度。(2)據圖分析可知，PCR擴增片段F1與片段F2后，需要通過重疊延伸的方式構建融合基因。引物F2－F的部分序列與引物F1－R的部分序列可互補，且引物F2－F的部分序列與F1片段(EGFP)靠近右側(3′端)的序列一致；引物F1－R的部分序列與F2片段(AnB1)靠近左側(5′端)的序列互補配對，因此引物F2－F和引物F1－R的序列分別與C和D對應。(3)傳統重組質粒構建需要使用限制酶切割質粒使其具有與目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA連接酶將目的基因和質粒連接成重組質粒。將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶的作用下發(fā)生同源重組形成環(huán)化質粒，不需要使用限制酶和DNA連接酶。(4)采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，利用稀釋涂布平板法接種，可能形成的菌落數較低，不在30～300的范圍內，A錯誤；抗性平板上未長出菌落的原因可能是重組質粒未能成功導入大腸桿菌，B錯誤；轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，一般含有重組質粒的大腸桿菌才能發(fā)展為菌落，故不會出現大量雜菌形成的菌落，C錯誤；稀釋涂布平板和平板劃線法均為分離純化細菌的方法，用稀釋涂布平板法在抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化，D正確。(5)EGFP為720bp，AnB1為390bp，二者的總大小為720bp＋390bp＝1110bp，用引物F1－F和F2－R進行了PCR擴增，P1、P2的擴增產物與電泳結果符合，可以舍棄的質粒有P3、P4。(6)瓊脂糖凝膠電泳技術僅能用于分析待檢測DNA分子的大小，無法確定待檢測DNA分子的堿基序列，因此對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認。(2022·江蘇卷)纖毛是廣泛存在的細胞表面結構，功能異?？梢l(fā)多種疾病。因此，研究纖毛形成的作用機制具有重要意義。請回答下列問題：(1)纖毛結構如圖Ⅰ所示，由細胞膜延伸形成的纖毛膜主要由__脂質和蛋白質__組成?；w由中心體轉變而來，中心體在有絲分裂中的功能是__發(fā)出星射線，形成紡錘體(與紡錘體的形成有關)__。圖Ⅰ(2)某病人腎小管上皮細胞纖毛異常，為了分析纖毛相關基因X是否發(fā)生了變異，對基因X進行了PCR擴增與產物測序。從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節(jié)鹽濃度，將與核蛋白結合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0mol·L－1的目的是__溶解DNA__。PCR擴增時，需在__耐熱/耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)__催化下，在引物的__3′__端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。(3)為研究蛋白質X在細胞中的定位，構建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可指示其在細胞內位置。將X－GFP基因融合片段M導入如圖Ⅱ所示載體質粒Y，構建Y－M重組質粒(在EcoRⅤ位點插入片段)。請完成下表。eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖Ⅱ))限制酶識別序列BamHⅠG↓GATCCEcoRⅤGAT↓ATCHindⅢA↓AGCTTBglⅡA↓GATCT序列編號Y－M連接處測序后部分序列Q15′…AGATCTCCGATATT…3′Q25′…AGATCTCCAAGCTT…3′Q35′…AAGCTTCCGGATCC…3′Q45′…AAGCTTCCGATATC…3′圖Ⅲ分步實驗目標簡易操作、結果、分析PCR鑒定正向重組質粒Y－M①選擇圖Ⅱ引物__a、b__；②PCR目的產物約為__1100__bp確保M及連接處序列正確③質粒測序，圖Ⅲ中正確的是__Q4__(選填序列編號)檢測融合蛋白定位④對照質粒Y－GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y－M分別導入細胞，發(fā)現對照組整個細胞均有綠色熒光而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明__蛋白質X在細胞中定位于纖毛基部__(4)為研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA，經__逆轉錄__形成cDNA作為模板，PCR擴增結果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環(huán)數)。從理論上估算，在PCR擴增20個循環(huán)的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的__32__倍。解析：(1)纖毛膜是由細胞膜延伸而來，故成分是一樣的，主要是脂質和蛋白質。中心體與有絲分裂過程中紡錘體的形成有關，動物細胞有絲分裂前期，中心體發(fā)出星射線，形成紡錘體。(2)DNA在0.14mol·L－1的NaCl溶液中溶解度最低，而可溶于2.0mol·L－1的NaCl溶液，故添加NaCl至2.0mol·L－1的目的是溶解DNA。PCR擴增時，需在耐高溫的DNA聚合酶(即TaqDNA聚合酶)的催化下，在引物的3′端進行DNA鏈的延伸(DNA的合成方向是從5′端到3′端)。(3)由圖中限制酶切位點和引物箭頭方向可知，PCR應選擇圖Ⅱ中的引物a和引物b，則PCR目的產物長度約為300＋800＝1100bp。在EcoRⅤ位點插入片段構建Y－M重組質粒，則Y－M的連接處上游應含有HindⅢ＋EcoRⅤ的識別序列，下游應含有EcoRⅤ＋BamHⅠ的識別序列，根據圖Ⅲ中各限制酶識別序列，表中序列Q4符合。實驗組熒光集中在纖毛基部，說明蛋白質X在細胞中定位于纖毛基部。(4)RNA經逆轉錄形成cDNA。Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環(huán)數，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20，說明病人基因Z表達較弱，達到同樣強度時，健康人比病人多5個循環(huán)，故從理論上估算，在PCR擴增20個循環(huán)的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的25＝32倍。審答指導表格型試題的考查主要以實驗設計和操作步驟、結果結論的分析為主體，因此對探究性實驗要整體和局部相結合，要點和易錯點相結合，分析卡點，疏通堵點，抓住增分點，建立操作要點和實驗目的之間的“因果循環(huán)關系”?；蚬こ毯蚉CR問題中常以此形式，或結合其他情境進行綜合考查。衍射訓練由于C4途徑有更高的光合作用能力，科學家正試圖采用基因工程手段將C4植物的相關基因克隆到水稻(C3植物)中以提高產量。下表是相關研究中的一些步驟，請根據題意完成以下表格。實驗目的方法步驟要點獲得目的基因PCR擴增出目的基因片段構建載體質粒將目的基因克隆進Ti載體質粒大量培養(yǎng)水稻細胞①__進行植物細胞培養(yǎng)獲得愈傷組織__轉化細胞用農桿菌轉化轉基因細胞篩選②__用含抗生素的培養(yǎng)基篩選(或用選擇培養(yǎng)基篩選)__誘導植株形成③__調控培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比例誘導形成完整植株__轉基因植株分析④__PCR鑒定基因、酶活力測定、測定光合作用能力__配套精練1．(2023·揚州中學)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應非特異條帶的產生，以下措施中有效的是(D)A．增加模板DNA的量 B．延長熱變性的時間C．延長延伸的時間 D．提高復性的溫度解析：增加模板DNA的量可以提高反應速度，但不能有效減少非特異條帶；延長熱變性的時間和延長延伸的時間會影響變性延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有效減少反應非特異條帶；非特異產物增加的原因可能是復性溫度過低，造成引物與模板的結合位點增加，故可通過提高復性的溫度來減少反應非特異條帶的產生。2．循環(huán)閾值(Ct值)是通過PCR等技術手段，使病毒的核酸擴增產物達到可檢測水平所需的循環(huán)次數。下列說法錯誤的是(B)A．Ct值為40和Ct值為35的核酸擴增產物的量可能相等B．Ct值越高，則表示所檢測的樣本中病毒濃度越高，檢測所需的時間越長C．PCR反應過程中每次循環(huán)都要消耗兩種引物D．PCR反應緩沖液中添加的Mg2+可以激活耐高溫的DNA聚合酶解析：由于樣品中的核酸含量不同，則Ct值為40和Ct值為35的核酸擴增產物的量可能相等，A正確；Ct值越高，則表示所檢測的樣本中病毒濃度越低，檢測所需的時間越長，B錯誤；PCR產生的DNA分子是雙鏈的，每條鏈都需要一種引物，則PCR反應過程中每次循環(huán)都要消耗兩種引物，C正確；用PCR擴增目的基因時，反應緩沖液中一般要添加Mg2+來激活耐高溫的DNA聚合酶，D正確。3．(2024·連云港調研)數字PCR技術通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元最多包含一個拷貝的目標分子(DNA模板)，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析，如下圖所示。下列相關敘述錯誤的是(B)A．PCR每一循環(huán)包括變性、復性(退火)和延伸三步B．數字PCR可以在常溫下進行，降低了檢測成本C．每個反應單元有無熒光取決于是否含有目標分子D．數字PCR可實現對樣品中目標分子的絕對定量分析解析：PCR每一循環(huán)都包括變性、復性和退火三步，A正確。數字PCR也是體外DNA復制，需要高溫使DNA變性，B錯誤。每個單元最多包含一個拷貝的目標分子，如果反應單元中有目標分子，經PCR可以擴增大量目標分子，利用熒光檢測時出現熒光信號。如果反應單元中沒有分配到目標分子，反應單元不進行DNA復制，沒有產物，利用熒光檢測時不出現熒光信號，C正確。起始待測樣品分配時，待分析PCR反應體系每個反應單元中最多分配有1個DNA分子，所以檢測時，有多少單元有熒光信號，待測樣品中起始就有多少DNA分子，所以數字PCR可實現對樣品中目標分子的絕對定量分析，D正確。4．(多選)(2024·淮安調研)引物在極大程度上決定了PCR的成敗，下列關于引物的說法，正確的有(ABD)A．PCR和生物體內的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是單鏈DNAB．若引物的CG堿基含量相對較高，PCR退火步驟的溫度需要適當升高C．在PCR的退火步驟，兩種引物分別結合在模板鏈的3′端和5′端D．若初始有10個胰島素基因，PCR中進行10輪循環(huán)，至少需要20460個引物分子解析：PCR和生物體內的DNA合成都需要引物，體內的DNA復制引物通常是RNA，PCR引物一般是單鏈DNA，A正確；G與C之間有3個氫鍵，穩(wěn)定性高，若引物的CG堿基含量相對較高，PCR退火步驟的溫度需要適當升高，B正確；在PCR的退火步驟，兩種引物都結合在模板鏈的3′端，C錯誤；若初始有10個胰島素基因，PCR中進行10輪循環(huán)，得到10×210個＝10240個DNA分子，共1024×2＝20480條鏈，由于初始的20條鏈不需要引物，故至少需要20480－20＝20460個引物分子，D正確。5．(多選)(2023·南通期末)多重PCR是指在反應體系中加入多種引物，最終擴增出多種目的DNA片段的技術，如圖。相關敘述正確的是(ACD)A．多重PCR加入的引物之間不能互補配對形成局部雙鏈B．不同對引物的退火溫度差異越大，擴增的特異性越強C．多重PCR擴增出的大小不一的DNA片段可用電泳檢測D．多重PCR可用于多種病原體感染的檢測解析：多重PCR加入的不同引物的堿基排列順序不能互補，如果互補，就會造成引物之間形成雙鏈，不能與模板鏈結合，降低擴增的效率，A正確；一般而言，引物的GC含量越高，結合特異性越強，擴增的特異性越強，B錯誤；電泳技術可分離不同大小的DNA分子，故多重PCR擴增出的大小不一的DNA片段可用電泳檢測，C正確；PCR鑒定病原體的原理是堿基互補配對，該體系中加入多種引物，最終擴增出多種目的DNA片段，故多重PCR可用于多種病原體感染的檢測，D正確。6．(多選)(2024·南通10月質監(jiān))交錯PCR能實現同源基因的重組(如圖，僅示單鏈)。第一輪延伸15s，獲得短產物①②。在第二輪開始時(95℃)產物①②與原來模板分開，然后(55℃)隨機地與不同模板交錯結合，延伸15s，合成交錯產物③④。每一輪擴增僅延伸一小段，經過多輪“產物—模板”交替結合、延伸，最終擴增出交錯重組基因產物。相關敘述正確的是(AB)A．交錯PCR原理是DNA半保留復制B．交錯PCR延伸溫度設定為55℃可增加交錯次數C．上一輪交錯產物需與模板鏈嚴格配對才能繼續(xù)下一輪擴增D．若交錯循環(huán)20輪，一共產生220個DNA分子解析：交錯PCR是PCR技術的延伸，利用了DNA半保留復制，A正確；在第二輪開始時(95℃)產物①②與原來模板分開，然后(55℃)隨機地與不同模板交錯結合，延伸15s，合成交錯產物③④，故延伸溫度設定為55℃可增加交錯次數，B正確；交錯延伸PCR與普通PCR技術的區(qū)別是每輪擴增僅延伸一小段，經過多輪“產物—模板”交替結合、延伸，最終擴增出交錯重組基因片段混合產物，故上一輪交錯產物不需與模板鏈完全配對也可繼續(xù)下一輪擴增，交錯循環(huán)20輪，也可能只產生1個DNA分子，C、D錯誤。7．基因定點突變是指按照特定的要求，使基因的特定序列發(fā)生插入、刪除、置換、重排等變異。圖甲是一種PCR介導的基因定點突變示意圖，圖乙是研究人員利用基因M1構建基因表達載體的過程。請回答下列問題：eq\o(\s\up7(),\s\do5(甲))eq\o(\s\up7(),\s\do5(乙))(1)進行基因定點突變的PCR反應體系中，除加入引物和模板DNA外，一般還需要加入__Taq酶、dNTP(緩沖液、Mg2+)等__，圖甲所示的基因定點突變技術需要__3__次PCR，獲得產物A需要的引物是__引物1和引物3__。(2)研究人員對PCR的中間產物A、B進行純化后，利用圖中相關酶對基因M和產物A、B進行充分酶切后得到不同的片段，長度(kb)如下表，則圖中基因敲除片段的長度為__0.23kb__，基因M1的長度為__6.09kb__?；騇AB長度3.24、2.8、0.15、0.132.8、0.093.24、0.05(3)通過圖甲過程獲得的基因M1仍需要大量擴增，此時選擇的引物是__引物1和引物2__，為了與圖乙中的Ti質粒相連，還需要分別在它們的__5′__端引入限制酶__HindⅢ、PstⅠ__的識別序列。(4)構建基因表達載體時，M1基因必需插入Ti質粒的__T－DNA__中，原因是__Ti質粒上的T－DNA能夠轉移并整合到受體細胞的染色體上__。解析：(1)進行基因定點突變的PCR反應體系中，除加入引物和模板DNA外，一般還需要加入Taq酶、dNTP(緩沖液、Mg2+)等。從圖甲可以看到，從加入引物到獲得基因M1總共經歷了3次PCR，產物A的兩端互補的引物是1和3。(2)圖中↓表示酶切位點，基因M上有三個酶切位點(箭頭處)，完全酶切產生4個片段，分別為3.24kb、2.8kb、0.15kb、0.13kb，A片段酶切后產生2個片段，分別為2.8kb、0.09kb，B片段酶切后產生2個片段，分別為3.24kb、0.05kb，圖中A片段和B片段的－－－－是相同的，因此－－－－處為0.05kb，則基因M1的長度為2.8＋0.05＋3.24＝6.09kb，因此基因敲除片段的長度為3.24＋2.8＋0.15＋0.13－6.09＝0.23kb。(3)獲得基因M1后，與M1兩條鏈兩端互補的引物是引物1和引物2。由于質粒上有三個酶切位點，切割后會出現不同的黏性末端，而基因M1兩端沒有能與黏性末端互補的序列，故需要分別在基因兩條鏈的5′端引入限制酶的識別序列，根據基因M1插入質粒的位置，可知添加的是限制酶HindⅢ、PstⅠ的識別序列。(4)構建基因表達載體時，M1基因必需插入Ti質粒的T－DNA中，因為Ti質粒上的T－DNA能夠轉移并整合到受體細胞的染色體上，才能使目