物理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的進展

物理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的進展一.細(xì)胞融合簡介二.傳統(tǒng)物理融合方法三.其他物理融和方法細(xì)胞融合技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的一項新興細(xì)胞工程技術(shù)，在外力（誘導(dǎo)劑或促融劑）作用下，2個或2個以上的異源（種、屬間）細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合，并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象稱為細(xì)胞融合（cellfusion）或細(xì)胞雜交。(cellhybridization)它是利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，把來自于不同種生物的單個細(xì)胞融合成1個細(xì)胞，這個新細(xì)胞（雜合細(xì)胞）得到了來自2個細(xì)胞的遺傳物質(zhì)（包括細(xì)胞核的染色體組合和核外基因），將具有新的遺傳學(xué)或生物學(xué)特性。細(xì)胞融合技術(shù)作為細(xì)胞工程的核心基礎(chǔ)技術(shù)之一,已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域取得了開創(chuàng)性的研究成果,而且應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴大。細(xì)胞融合技術(shù)不僅為核質(zhì)關(guān)系、基因調(diào)控、遺傳互補、細(xì)胞免疫學(xué)、腫瘤發(fā)生、基因定位、衰老控制等理論領(lǐng)域的研究提供了有力的手段,而且被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)生生物學(xué),特別是在單克隆抗體及動植物遠(yuǎn)緣雜交育種等方面具有十分重要的意義。隨著細(xì)胞融合技術(shù)研究的不斷深入,細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展前景及其產(chǎn)生的影響將日益顯著。

細(xì)胞融合方法有生物法、化學(xué)法和物理法，其中生物方法因病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價差異大、實驗的重復(fù)性差、融合率很低等。目前，這種方法主要適用于動物細(xì)胞融合，用于實驗室?；瘜W(xué)法因為存在對細(xì)胞損傷大、殘存毒性、融合率較低及經(jīng)驗性大等缺陷，目前應(yīng)用也不廣。而物理方法因融合頻率高，是PEG的100倍；操作簡便、快速；對細(xì)胞無毒；可在鏡下觀察融合過程

等優(yōu)點，顯示出強大的生命力。

二.傳統(tǒng)物理方法1.電融合法2.激光融合法1.電融合法

電融合誘導(dǎo)法是指利用電場來誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，在施加瞬間強脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促使細(xì)胞融合的方法。

自從1978年Zimmermann首先采用電脈沖方法成功地誘導(dǎo)了細(xì)胞電穿孔、電融合以來近三十年里,電穿孔和電融合技術(shù)不斷發(fā)展完善成為一門比較成熟的學(xué)科,得到非常廣泛地應(yīng)用。

1983～1988年期間,以Zimmermann為主的工作小組通過動物、植物和微生物細(xì)胞電融合實驗得出高頻短脈沖是可行的。并且認(rèn)為高頻短脈沖電信號可以用于細(xì)胞操控、基因工程和細(xì)胞融合,證明了利用電場這一物理因素誘導(dǎo)細(xì)胞融合具有普遍的適用性。由于電融合的可控性,使人們第一次在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的融合過程,且電極間細(xì)胞的融合率高達(dá)10～80%。

1991年Naton等提出利用融合對象間密度的差異來實現(xiàn)融合時的有序隊列。在兩電極間放入合適密度的媒質(zhì),混合的兩種類型的原生質(zhì)體就會形成兩個不同的單層結(jié)構(gòu);在此情況下,可以獲得很高的異核融合產(chǎn)率。融合率取決于所加電場的方向,如果接觸區(qū)域是建立在陽極面,那么融合率就會比建立在陰極面提高兩倍。他們采用的實驗樣本是美洲狼尾草葉肉細(xì)胞和煙草葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體。

1993年俄羅斯研究人員Abidor等采用了一種新的方式來研究細(xì)胞融合和高電場中細(xì)胞膜的電學(xué)特性。他們將L929細(xì)胞和其它的四種類型細(xì)胞的懸浮液放入特殊的腔室中,通過離心力作用將細(xì)胞緊壓同時所測量緊壓體系的電阻值間接地發(fā)映出離心過程中狀態(tài)的變化情況,并通過對比試驗揭示出膜接觸程度的近與遠(yuǎn)是影響細(xì)胞融合率高與低的關(guān)鍵因素。

2000年Mekid等首次報道了電場作用下組織中發(fā)生細(xì)胞電融合過程,他們采用B16鼠科黑素瘤組織,在不施加和施加500V/cm,1350V/cm,2000V/cm等不同場強條件下,得到了電融合后的細(xì)胞并通過相互對比得出高場強作用下融合過程比較明顯的實驗結(jié)果。雖然此時細(xì)胞融合率已經(jīng)比較高,但是電極間距離仍然屬于毫米級,所以在進行細(xì)胞電融合時,電壓必須提高到300V以上才能夠達(dá)到細(xì)胞電融合所需的電場強度。此外,融合裝置體積比較大但是細(xì)胞融合通量較低,這些不利因素都限制了細(xì)胞電融合的推廣。

2004年日本東京大學(xué)的研究人員采用硅電極、玻璃與PDMS相結(jié)合的微流控芯片制作出了高縱橫比的電極,并且采用低電壓技術(shù)實現(xiàn)了高效的細(xì)胞融合,融合率達(dá)到75%。

2007年Jongil等在“芯片實驗室”水平上通過電融合手段,實現(xiàn)了對日本美口菌和珊瑚菜的電融合過程。他們的芯片是由玻璃作為基底,PDMS通過鑄模方式實現(xiàn)微流控通道的制作然后利用等離子鍵合使上下兩層緊密結(jié)合,很大程度上提高了細(xì)胞1:1的對準(zhǔn)并發(fā)生融合的概率。在交流電壓1～2MHz峰峰值8～10V的矩形脈沖作用下實現(xiàn)排隊過程;然后采用周期為10～100毫秒幅值為250mV的直流脈沖來控制和保持融合。此外,該課題組對電極電場分布進行了仿真。同年Wang等采用微流控電穿孔技術(shù),制造了PDMS彈性閥。當(dāng)施加直流電壓脈沖時,PDMS閥能夠?qū)崿F(xiàn)快速關(guān)斷產(chǎn)生電壓脈沖序列。在此條件下的細(xì)胞融合芯片中的細(xì)胞,能夠進行排隊及融合。而且此技術(shù)解決了制造電極和高電壓脈沖電源的難度問題。

2.激光融合法

20世紀(jì)80年代中期又發(fā)明了激光融合器,迅速崛起的激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合術(shù)是利用激光微束對相鄰細(xì)胞接觸區(qū)的細(xì)胞膜進行破壞(或擾動),可將兩個不同特性、不同大小的細(xì)胞在顯微鏡下實現(xiàn)融合。即利用光鑷捕捉并拖動一個細(xì)胞使之靠近另一個細(xì)胞并緊密接觸,然后對接觸處進行脈沖激光束處理,使質(zhì)膜發(fā)生光擊穿,產(chǎn)生微米級的微孔。這樣,由于質(zhì)膜上微孔的可逆性,細(xì)胞開始變形融合,最終成為一個細(xì)胞。

1987年和1989年德國海德堡理化研究所用準(zhǔn)分子激光器使油菜原生質(zhì)體融合,從開始照射到完成融合僅需幾秒鐘,對融合產(chǎn)物觀測,發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)仍在運動,說明融合后的細(xì)胞仍能存活。激光微束融合法與以前的病毒法、PEG法、電融合法相比較,可選擇任意兩個細(xì)胞進行融合,易于實現(xiàn)特異性細(xì)胞融合,作用于細(xì)胞的應(yīng)力小,定時、定位性強,損傷小,參數(shù)易于控制,操作方便,可利用監(jiān)控器清晰地觀察整個融合過程,實驗重復(fù)性好,無菌,無毒性。

但它只能逐一處理細(xì)胞,不能像其他方法一樣同時處理大量細(xì)胞。細(xì)胞間相互接觸是實現(xiàn)細(xì)胞融合的前提,目前,最新穎的方法是利用激光光阱建立兩細(xì)胞間接觸,即光鑷(poticaltweezers)利用激光高斯光束光場的梯度力把細(xì)胞從光束邊緣拉向光束中間,在光斑直徑與光波波長尺度相比擬時,指向束腰的軸向梯度力要大于沿光束方向的散射力,該梯度力把細(xì)胞豎直地拉到激光束腰下方處,從而實現(xiàn)對細(xì)胞的操作。

缺點三現(xiàn)代物理方法1.基于微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)

2.高通量細(xì)胞融合芯片

3.空間細(xì)胞融合技術(shù)

4.離子束細(xì)胞融合技術(shù)

5.非對稱細(xì)胞融合技術(shù)

1.基于微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)

隨著微機電系統(tǒng)（MEMS）技術(shù)和微加工技術(shù)的發(fā)展，微電極陣列的設(shè)計加工制作也日趨成熟，加之微通道網(wǎng)絡(luò)可以整合到生物芯片之上，這將使得微流控系統(tǒng)成為細(xì)胞融合的理想平臺，利用微流控系統(tǒng)可以按照預(yù)定的要求大量融合異種細(xì)胞。目前，基于微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)已成為細(xì)胞融合技術(shù)研究的重點領(lǐng)域。利用基于芯片技術(shù)的微流控系統(tǒng)不僅可以實現(xiàn)對細(xì)胞甚至單個細(xì)胞的操控，比如轉(zhuǎn)移、定位、變形等，也可以同時輸送、合并、分離和分選大量細(xì)胞，細(xì)胞融合在芯片上可以通過并行或快速排隊的方式實現(xiàn)。此外由于在微通道內(nèi)的腔體容積很小，所以會大幅減少細(xì)胞融合中所需的細(xì)胞數(shù)量，同時細(xì)胞融合率和雜合細(xì)胞的成活率會大大提高。

2.高通量細(xì)胞融合芯片

高通量細(xì)胞融合芯片利用微電極陣列在微米范圍內(nèi)（10-40微米）產(chǎn)生的高強度、高梯度輻射電場，使得細(xì)胞在特殊輻射電場的作用下產(chǎn)生介電質(zhì)電泳力，精確處理和刺激預(yù)定的目標(biāo)細(xì)胞，從而使目標(biāo)細(xì)胞按照預(yù)先設(shè)計的方向（可以是任何預(yù)先設(shè)計好的方向）以預(yù)定的速度（可以是不同種的細(xì)胞以不同的速度定向）移動，從而按照設(shè)計要求準(zhǔn)確地、大批量地得到目標(biāo)細(xì)胞配型，集成微電極陣列的微流控系統(tǒng)，可以方便靈活地實現(xiàn)對細(xì)胞的操作、隔離和轉(zhuǎn)移。由于在微通道內(nèi)微電極間距可以做得很小，因此獲得同樣強度的輻射電場強度只需施加較低電壓的交變電場和脈沖即可，不用加載昂貴的高電壓發(fā)生裝置。高通量細(xì)胞融合芯片可以與化學(xué)誘導(dǎo)融合、電誘導(dǎo)融合等方法相互結(jié)合，比如：在細(xì)胞融合緩沖液中加入少量的PEG可大大提高細(xì)胞的融合率。此外，二價陽離子（例如：鈣離子）以及蛋白酶對細(xì)胞進行預(yù)處理，融合率也可大幅提高。然而，截至目前各國與此相關(guān)的細(xì)胞融合實驗工作只有幾篇文章見諸報端，許多構(gòu)想也只是在理論層次上的探討。3.空間細(xì)胞融合技術(shù)

由于地球引力的存在，有液泡的原生質(zhì)體與無液泡的原生質(zhì)體的密度差加大，異源細(xì)胞間的融合得率十分有限。在利用動物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體過程中，由于無法排除地球引力的影響，要提高淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合得率相當(dāng)困難。20世紀(jì)80年代以來，人們在空間材料科學(xué)的啟發(fā)下，試圖利用空間微重力條件改進細(xì)胞融合技術(shù)。大量的飛行實驗結(jié)果表明，在微重力條件下酵母細(xì)胞的融合得率有很大的增加，融合得率增加主要是由于降低了重力沉降影響，而雜種細(xì)胞的活力增加可能是由細(xì)胞排列時間縮短引起的。在取得這些成功實驗的基礎(chǔ)上，進一步研究融合后的細(xì)胞在空間培養(yǎng)的可能性已經(jīng)具備。

4.離子束細(xì)胞融合技術(shù)

雷電、輻射等自然過程中產(chǎn)生的低能離子可作用于生物體，20世紀(jì)80年代中期，中國科學(xué)院等離子體物理研究所的余增亮等人發(fā)現(xiàn)并證實了離子注入生物效應(yīng)和粒子沉積生物效應(yīng)的存在，建立了質(zhì)量、能量、電荷三因子作用機制體系。在離子束與生物體相互作用中，粒子的植入、動量的傳遞和電荷交換可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和跨膜電場的改變。據(jù)此原理，發(fā)展了離子束誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)。此項研究改變傳統(tǒng)的一對一細(xì)胞融合的弊端，減少供體細(xì)胞導(dǎo)入的染色體范圍，使融合更具目的性，大大減少篩選的工作量，將是細(xì)胞融合研究的一大進步。

5.非對稱細(xì)胞融合技術(shù)

非對稱細(xì)胞融合技術(shù)，是利用某種外界因素-常為γ射線，即γ融合.輻照某一細(xì)胞原生質(zhì)體，選擇性地破壞其細(xì)胞核，并用碘乙酰胺堿性蕊香紅6G處理在細(xì)胞核中含有優(yōu)良基因的第2種原生質(zhì)體，選擇性地使其細(xì)胞質(zhì)失活。然后融合來自這2個原生質(zhì)體品系的細(xì)胞，從而實現(xiàn)所需胞質(zhì)和細(xì)胞核基因的優(yōu)化組合，或使前者被打碎的細(xì)胞核染色體片段中的個別基因滲入到后者原生質(zhì)體的染色體內(nèi)，實現(xiàn)有限基因的轉(zhuǎn)移，從而在保留親本之一全部優(yōu)良性狀的同時改良其某個不良性狀。

實踐表明，非對稱細(xì)胞融合技術(shù)通過γ射線照射，為實現(xiàn)供體親本少數(shù)基因的轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造種間、屬間雜種，提供了可能性。值得注意的是，此方法特別適用于細(xì)胞質(zhì)雄性不