DB21T 2734.2-2017 病菌PCR 分型診斷方法 第2部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR 分型檢測方法　　

DB21DB21/T2734.2—2017病菌PCR分型診斷方法MethodofPCRtypingdiagnosisforbacterialPart2：MethodofPCRtypingdetectionforClostridiumperfringens2017-02-23發(fā)布2017-03-23實施遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2734.2—2017 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5A.1.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶 5A.1.2TAE(三羥甲基氨基甲烷一乙酸) 5 5DB21/T2734.2—2017本部分為病菌PCR分型診斷方法的第2部分。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心、1DB21/T2734.2—2017本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C、D、E五型PCR檢測方本標(biāo)準(zhǔn)適用于產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查，適用于動物糞便、腸內(nèi)容物及純本標(biāo)準(zhǔn)中的試驗操作應(yīng)在生物安全Ⅱ級（BSL-2）以上的實驗室進行。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用GB/T4789.13食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗產(chǎn)氣GB16548-2006病害動物和病害動物產(chǎn)品生物安SN/T2025-2007動物檢疫實驗室生物安DNA：脫氧核糖核酸（Diethylpyrocarbonate）bp：堿基對（basepair）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（Trisacetate-EDTAbuffer）對引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點，通過變性、退火和延伸，體外2DB21/T2734.2—2017微量移液器和吸頭等。6.375%乙醇：用無水乙醇和滅菌雙蒸水配制，-6.9TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳用于PCR反應(yīng)的引物濃度為20μmol/L，其序列及擴增產(chǎn)物大小見表1。F5’-TTACTGCCGTTGATAGCG-3’R5’-TCATTTCCTGGGTTGTCC-3’F5’-TTTCCGGTTAGATACTCGAT-3’R5’-ACAGTTTCTTTCACGCTCCA-3’F5’-CTCATAATGTCCCTTCAC-3’R5’-CTCATCTCCCATAACTGCT-3’F5’-AATGGCGATGAAAAGCCTACAC-3’R5’-GCATAACCTGGAATGGCTGATA-3’F5’-TAGAATCAAATACCGCTGGTGA-3’R5’-CTGGATATGCTGCAACTAAAGG-3’7.1樣品的采集、前處理、存放與運輸采樣及樣品前處理過程中應(yīng)戴一次性手套，樣3DB21/T2734.2—20177.1.3腸內(nèi)容物的采集與前處理無菌采取病死或剖殺動物的小腸內(nèi)容物，裝入15mL滅菌離心管中，按1﹕10倍體積加入無菌生理鹽水，充分攪拌，室溫放置30min，12000rpm離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號備用。7.1.4糞便的采集與前處理用藥匙無菌采取發(fā)病動物的新鮮糞便，裝入15mL滅菌離心管中，按1﹕10倍體積加入無菌生理鹽水，充分攪拌，室溫放置30min，12000rpm離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號備用。7.1.5產(chǎn)氣莢膜梭菌純培養(yǎng)物依據(jù)GB/T4789.13和SN0177進行產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)。挑取產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落，用1mL無菌生理鹽水制備成一定濃度的菌懸液。然后轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中編號備用。采集或處理的樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融(凍融不超過3次)。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在4h之內(nèi)運送到實驗室檢測；無冷藏條件的，于采樣后2h內(nèi)送達實驗室。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進行樣品的生物安全標(biāo)識。7.2.1.1取n個滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性對照7.2.1.3取與7.2.1.1中相同數(shù)量滅菌的1.5mL離心管，吸取900μL上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管7.2.1.44℃12000g離心5min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體，加入1mL75%乙7.2.1.54℃12000g離心5min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體。如此洗2次。建立25μL反應(yīng)體系，按下列組分加入PCR專用離心管中：滅菌蒸餾水17.375μL10×PCRBuffer2.5μL2.5mmol/LdNTP2μL4ExTaqDNA聚合酶上游特異性PCR引物下游特異性PCR引物DNA模板DB21/T2734.2—201794℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃終延伸10min。將PCR擴增產(chǎn)物6μL與1μL上樣緩沖液混合，點樣于1%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠）板點樣孔中，瓊脂糖凝膠板一側(cè)點樣孔加入DL2000DNAMarker（分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物），緩沖液為1×TAE，以5V/cm電壓電泳25min。8試驗成立的條件當(dāng)試驗結(jié)果同時符合以下條件時試驗成立，否則實驗結(jié)果無效：陰性對照未出現(xiàn)特異性條帶；A型產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性對照出現(xiàn)475bp的α-毒素擴增條帶；B型產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性對照出現(xiàn)475bp的α-毒素、513bp的β-毒素和272bp的ε-毒素擴增條帶；C型產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性對照出現(xiàn)475bp的α-毒素和513bp的β-毒素擴增條帶；D型產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性對照出現(xiàn)475bp的α-毒素和272bp的ε-毒素擴增條帶；E型產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性對照出現(xiàn)475bp的α-毒素、692bp的ι-毒素A和111bp的ι-毒素B擴增條帶。9結(jié)果判定紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果，試驗條件成立時，實驗結(jié)果可作為判定依據(jù)。如被檢樣品中出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，則可初步判斷被檢樣品中含有對應(yīng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因，初步判斷為陽性結(jié)果的樣品可通過復(fù)檢和核酸序列測定進行確認。如被檢樣品中未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，則可判斷被檢樣品中不含有對應(yīng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因。5DB21/T2734.2—2017 A.1.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（Ph8.二水乙二銨四乙酸二鈉（分析純）滅菌雙蒸水氫氧化鈉滅菌雙蒸水A.1.2TAE(三羥甲基氨基甲烷一乙酸)電泳緩沖液(50倍)羥基甲基氨基甲烷(Tris)（分析純）242g