流式細(xì)胞技術(shù)與流式細(xì)胞儀課件

11流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù)與流式細(xì)胞儀

11流式細(xì)胞技術(shù)主要內(nèi)容基本原理基本結(jié)構(gòu)主要性能指標(biāo)臨床應(yīng)用11流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞儀的發(fā)展簡(jiǎn)史1934年Moldavan

使懸浮的血紅細(xì)胞從一個(gè)毛細(xì)玻璃管中流過(guò)，每個(gè)通過(guò)的細(xì)胞可被一個(gè)光電裝置記錄下來(lái)，這可謂流式細(xì)胞儀的最初模型。1947年，Gucker首次采用鞘流原理對(duì)氣體中的微粒進(jìn)行計(jì)數(shù)。1953年，Crosland-Taylor利用同一原理，成功的設(shè)計(jì)了一種鞘流系統(tǒng)，配合光電技術(shù)對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。11流式細(xì)胞技術(shù)1969年VanDilla

和LosAlamos采用了Crosland-Taylor設(shè)計(jì)的層流流動(dòng)室和氬離子激光器開(kāi)發(fā)出了液流束、照明光軸，檢測(cè)系統(tǒng)三者互相垂直的流式細(xì)胞儀，成為目前各種流式細(xì)胞測(cè)量?jī)x的基礎(chǔ)。1972年，數(shù)位研究者在斯坦佛大學(xué)研制了一臺(tái)熒光激活細(xì)胞分選儀，它標(biāo)志著流式細(xì)胞儀商品化時(shí)代的真正到來(lái)。1974年，BD公司正式投產(chǎn)，商品名FACS-1TM.目前的主流生產(chǎn)商，美國(guó)的BD公司、Coulter公司。11流式細(xì)胞技術(shù)一、流式細(xì)胞儀的基本原理11流式細(xì)胞技術(shù)（一）流式細(xì)胞儀的分析原理單細(xì)胞液柱已標(biāo)記的單細(xì)胞懸液和鞘液硅化管流動(dòng)室噴嘴熒光檢測(cè)系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號(hào)熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號(hào)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之11流式細(xì)胞技術(shù)細(xì)胞組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA,RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性11流式細(xì)胞技術(shù)FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）11流式細(xì)胞技術(shù)

通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。（二）流式細(xì)胞儀的分選原理11流式細(xì)胞技術(shù)細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)不充電充電分選基本原理11流式細(xì)胞技術(shù)二、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)激發(fā)光源及光束成形系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)信號(hào)檢測(cè)和存儲(chǔ)系統(tǒng)顯示分析系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)11流式細(xì)胞技術(shù)（一）流動(dòng)室是FCM的核心部件，由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開(kāi)一個(gè)孔徑為的長(zhǎng)方形孔，供單個(gè)細(xì)胞通過(guò)，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心或下方。流動(dòng)室內(nèi)充滿了鞘流，其作用是將樣品流環(huán)包。11流式細(xì)胞技術(shù)鞘流原理細(xì)胞懸液流過(guò)檢測(cè)光束，約30%的細(xì)胞在流動(dòng)中明顯偏離軸心，有向流速較慢的區(qū)域聚焦的趨勢(shì)。阻塞管路聚焦的細(xì)胞直接影響測(cè)量結(jié)果由于細(xì)胞偏離軸心造成其移動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，降低檢測(cè)速度。激光束無(wú)法對(duì)準(zhǔn)照射在細(xì)胞中心11流式細(xì)胞技術(shù)鞘流原理流動(dòng)的液體可分為穩(wěn)流(層流)和湍流兩種狀態(tài)層流原理：液體流動(dòng)狀態(tài)有一個(gè)分界點(diǎn)，即雷諾數(shù)其定義為：在一個(gè)直徑為的管子內(nèi)，液體的流速為v，密度為，黏滯系數(shù)為，當(dāng)時(shí)，液流處于層流狀態(tài)；當(dāng)時(shí)，液流處于湍流狀態(tài)。流式細(xì)胞儀中要求標(biāo)本處于層流狀態(tài)。常把流速限制在10m/s以下。11流式細(xì)胞技術(shù)鞘流原理由此發(fā)展的鞘流技術(shù)，實(shí)現(xiàn)兩種液體的同軸流動(dòng)，標(biāo)本位于軸心穩(wěn)定流動(dòng)，外面包被有鞘液。鞘流處于湍流狀態(tài)，圍繞標(biāo)本噴嘴高速流動(dòng)，這樣就使得標(biāo)本流與鞘流形成穩(wěn)定的同軸流動(dòng)狀態(tài)。由于標(biāo)本噴嘴處于流動(dòng)室的中心，就使得標(biāo)本流在鞘流包被下，恒定處于同軸流動(dòng)的中心位置，其精度可以穩(wěn)定在幾個(gè)微米之內(nèi)。標(biāo)本流的位置的穩(wěn)定可通過(guò)調(diào)整它與鞘液流速的比例來(lái)實(shí)現(xiàn)，一般比例在1:50到1：幾百之間。11流式細(xì)胞技術(shù)鞘流原理Bernoulli定律：當(dāng)液體流經(jīng)截面不同的管道時(shí)，有，S和v分別是兩個(gè)管道的截面積和液體的流速。鞘液流動(dòng)方向LowerpressureTheBernoulliEffectVelocityGradient11流式細(xì)胞技術(shù)液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)11流式細(xì)胞技術(shù)（二）激光光源流式細(xì)胞儀的激發(fā)光源通常采用激光，通常用的激光包括氬離子激光（488nm）、He-Ne激光（633nm）和半導(dǎo)體激光（635nm)。由于細(xì)胞快速流動(dòng)，通過(guò)光照區(qū)的時(shí)間只有1微秒左右，且細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激光光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。11流式細(xì)胞技術(shù)11流式細(xì)胞技術(shù)(二)激光光源激光光源的寬度大于被測(cè)細(xì)胞，為零分辨率信號(hào)。狹縫掃描技術(shù)：11流式細(xì)胞技術(shù)（三）光學(xué)系統(tǒng)主要元件為濾光片，分長(zhǎng)通濾光片、短通濾光片、帶通濾光片。長(zhǎng)波通雙色性反射鏡：大于特定波長(zhǎng)的光通過(guò)而將小于特定波長(zhǎng)的光反射11流式細(xì)胞技術(shù)光學(xué)系統(tǒng)示意圖11流式細(xì)胞技術(shù)

細(xì)胞通過(guò)激光照射區(qū)時(shí)，受激光激發(fā)，產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散色光和熒光信號(hào)。（四）信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)11流式細(xì)胞技術(shù)（四）信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)散射光檢測(cè)

前向光散射（FSC,ForwardScatter

）側(cè)向光散射（SSC,SideScatter

）散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)或稱固有參數(shù)。以上兩種信號(hào)都是來(lái)自激光的原光束，其波長(zhǎng)與激光的波長(zhǎng)相同。熒光檢測(cè)(Fluoresencedetector)11流式細(xì)胞技術(shù)（1）前向散射光：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的信號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。11流式細(xì)胞技術(shù)FALSSensorLaser前向散射光示意圖11流式細(xì)胞技術(shù)（2）側(cè)向散射光：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°角散射的信號(hào)，側(cè)向散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。

11流式細(xì)胞技術(shù)FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光示意圖11流式細(xì)胞技術(shù)

測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

11流式細(xì)胞技術(shù)（3）熒光檢測(cè)熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。線性放大器和對(duì)數(shù)放大器11流式細(xì)胞技術(shù)FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細(xì)胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類幾種常見(jiàn)的熒光染料11流式細(xì)胞技術(shù)11流式細(xì)胞技術(shù)（1）熒光信號(hào)的面積和寬度所謂熒光信號(hào)的面積是采用對(duì)熒光光通量進(jìn)行積分測(cè)量，一般對(duì)DNA含量測(cè)量時(shí)，均采用面積(FL2－A)來(lái)計(jì)算。這是因?yàn)闊晒饷}沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的含量。熒光信號(hào)的寬度(如FL2－W)常用來(lái)區(qū)分雙聯(lián)體細(xì)胞11流式細(xì)胞技術(shù)11流式細(xì)胞技術(shù)（2）熒光補(bǔ)償原理11流式細(xì)胞技術(shù)雙激光立體光路技術(shù)11流式細(xì)胞技術(shù)參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖）設(shè)門分析技術(shù)（五）數(shù)據(jù)的顯示與分析11流式細(xì)胞技術(shù)FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、參數(shù)11流式細(xì)胞技術(shù)單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點(diǎn)圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析直分析方圖設(shè)門分析:REGION和GATE設(shè)置二、數(shù)據(jù)顯示方式11流式細(xì)胞技術(shù)

Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。

設(shè)門分析技術(shù)11流式細(xì)胞技術(shù)

由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖11流式細(xì)胞技術(shù)單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量信道(channel)11流式細(xì)胞技術(shù)雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)直方圖11流式細(xì)胞技術(shù)1.雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度11流式細(xì)胞技術(shù)雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖11流式細(xì)胞技術(shù)2.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。11流式細(xì)胞技術(shù)二維等高圖11流式細(xì)胞技術(shù)3.假三維等高圖11流式細(xì)胞技術(shù)（三）三參數(shù)直方圖11流式細(xì)胞技術(shù)

多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析11流式細(xì)胞技術(shù)（六）細(xì)胞分選器細(xì)胞分選器由水滴形成、分選邏輯電路、水滴充電和偏轉(zhuǎn)電路組成。1.小水滴的形成：液流從噴孔出來(lái)后，需要經(jīng)過(guò)一段距離才形成水滴。這段距離大概是10~20個(gè)波長(zhǎng)噴嘴的振動(dòng)頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。2.邏輯電路：為了分選細(xì)胞，需要細(xì)胞在經(jīng)過(guò)測(cè)量區(qū)時(shí)，F(xiàn)CM判斷出哪個(gè)細(xì)胞滿足分選條件，并產(chǎn)生一個(gè)邏輯信號(hào)；此信號(hào)驅(qū)動(dòng)充電脈沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖，當(dāng)滿足分選條件的細(xì)胞形成水滴時(shí)，充電脈沖正好對(duì)它進(jìn)行充電。11流式細(xì)胞技術(shù)11流式細(xì)胞技術(shù)3.水滴的充電與偏轉(zhuǎn)：當(dāng)水滴從流束上將要斷開(kāi)時(shí)，給含有這個(gè)水滴的流束充電，則水滴從流束上斷開(kāi)后變帶有同極性的多余表面電荷。下落的液滴通過(guò)一個(gè)由平行板電極形成的靜電場(chǎng)，水滴在電場(chǎng)中發(fā)生偏轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)電壓一般為2000~6000v，對(duì)于高速分選偏轉(zhuǎn)電壓可達(dá)8000v。11流式細(xì)胞技術(shù)分選速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。分選收獲率：實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過(guò)測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與分選速度成反比。分選的技術(shù)要求11流式細(xì)胞技術(shù)三、主要性能指標(biāo)靈敏度：衡量?jī)x器檢測(cè)微弱熒光信號(hào)的重要指標(biāo)，以能檢測(cè)到的單個(gè)微球上最少標(biāo)有FITC或PE熒光分子的數(shù)目表示。目前FCM<100.分辨率：用變異系數(shù)來(lái)表示，一般FCM在最佳狀態(tài)時(shí)，CV值<2%.前向散射光檢測(cè)靈敏度：可檢測(cè)直徑為0.2~0.5um的生物顆粒。分析速度：3000~6000個(gè)/秒11流式細(xì)胞技術(shù)CV值約小，曲線分布約窄約集中，測(cè)量誤差就約一般的FCM在最佳狀態(tài)時(shí)CV值小于2％。11流式細(xì)胞技術(shù)FACSCalibur11流式細(xì)胞技術(shù)11流式細(xì)胞技術(shù)11流式細(xì)胞技術(shù)四、流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求制備單細(xì)胞懸液是進(jìn)行流式細(xì)胞分析的第一步熒光染料的選擇和標(biāo)記細(xì)胞的方法是保證熒光信號(hào)產(chǎn)生的關(guān)鍵技術(shù)操作