DB21T 2252-2014 O型口蹄疫病毒RT-PCR檢測方法　　

ICS11.220B41DB21DB21/T2252—2014O型口蹄疫病毒RT-PCR檢測方法MethodofRT-PCRforthedetectionoftypeOfootandmouthdiseasevirus遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布1DB21/T2252—2014O型口蹄疫病毒RT-PCR檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了O型口蹄疫病毒（FMDV-O）RT-PCR檢測方法的實驗材料、儀器設(shè)備、試劑、操作步驟和結(jié)果判定，并介紹了其原理。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動物及動物產(chǎn)品中O型口蹄疫病毒的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-1992分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第302號獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范3縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。DEPC焦炭酸二乙酯RNA核糖核酸RT-PCR反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)dNTP脫氧核苷酸三磷酸bp堿基對O-P液牛、羊食道-咽部分泌物4原理FMDV是一種RNA病毒。RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA可作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)FMDV-O保守基因序列設(shè)計一對引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點，通過變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA。5實驗材料、儀器設(shè)備和試劑5.1實驗材料眼科剪、眼科鑷、稱量紙、1.5mL滅菌離心管（經(jīng)DEPC水處理）、0.2mL薄壁PCR管、瓊脂糖、500mL量筒、500mL三角瓶、吸頭（10μL、200μL、1000μL）。5.2儀器設(shè)備2DB21/T2252—2014分析天平、低溫高速離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、5.3試劑5.3.12.5mmol/LdNTP。5.3.2引物：上游引物5′-AGATTTGTGAAAGTAACACCA-3′，下游引物5′-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-35.3.310倍PCR緩沖液。5.3.41%溴化乙錠（EB）溶液（見第A.1）。5.3.5電泳緩沖液（50倍見第A.2）。5.3.61%瓊脂糖凝膠（見第A.3）。5.3.775%乙醇（見第A.4）。5.3.8滅菌DEPC水（見第A.5）。5.3.9上樣緩沖液(見第A.6)。5.3.10電泳緩沖液（1倍）（見第A.7）。5.3.11磷酸鹽緩沖液（0.04mol/L、pH7.4見第A.8）。5.3.12其他試劑：10U/μLAMV反轉(zhuǎn)錄酶、50U/μLRNA酶抑制劑、5U/μLTaqDNA聚合酶、異丙醇、25mmol/L氯化鎂溶液。注：除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682－1992的滅菌雙蒸水或超純水。6操作步驟6.1樣品的采集、保存運送和處理6.1.1樣品采集6.1.1.1水泡液：未破裂水泡中的水泡液用滅菌注射器吸出后裝入滅菌小瓶中（可加青霉素1000UI/mL，鏈霉素1mg/mL），加蓋密封，編號。6.1.1.2水泡皮：剪取新鮮水泡皮3～5g放入滅菌小瓶中，加6～10mL（2倍體積）50％甘油－磷酸鹽緩沖液(0.04mol/L、pH7.4),加蓋密封，編號。6.1.1.3肌肉或組織樣品：無菌采集淋巴結(jié)、脊髓、肌肉等組織樣品3～5g裝入潔凈的小瓶內(nèi)或其他滅菌容器，編號。6.1.1.4O-P液樣品：被檢動物在采樣前禁食(可飲水)12小時，以免反芻胃內(nèi)容物嚴(yán)重污染O-P液。采樣探杯在使用前經(jīng)0.2％檸檬酸或2％氫氧化鈉浸泡5min，再用自來水沖洗。每采完一頭動物,探杯要重復(fù)進(jìn)行消毒和清洗。采樣時動物站立保定，將探杯隨吞咽動作送入食道上部10～15cm處，輕輕來回移動2～3次，然后將探杯拉出。如采集的O-P液被反芻胃內(nèi)容物嚴(yán)重污染，要用生理鹽水或自來水3DB21/T2252—2014沖洗口腔后重新采樣。將探杯采集到的8～10mLO-P液倒入25mL以上的滅菌玻璃容器中,容器中應(yīng)事先加有8～10mL細(xì)胞培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液(0.04mol/L、pH7.4)，加蓋密封后充分搖勻，編號。6.1.2樣品保存與運送6.1.2.1樣品保存：采集的樣品冷藏送檢或盡快冷凍保存，避免反復(fù)凍融。6.1.2.2樣品運送：樣品裝入保溫壺或保溫桶中加冷凍劑和防震材料，加蓋密封，以最快方式，運送到實驗室。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品的生物安全標(biāo)識。6.1.3樣品處理6.1.3.1水泡液：不需處理，可以直接進(jìn)行核酸提取。6.1.3.2水泡皮、肌肉或組織樣品：取待檢樣品2.0g于潔凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加10mL磷酸鹽緩沖液(0.04mol/L、pH7.4)混勻制成1：5懸液，4℃下3000rpm離心15min，取上清液轉(zhuǎn)入無菌的1.5mLEppendorf管中，編號備用。6.1.3.3OP液樣品：樣品在混勻器上充分混合后，室溫放置30min，取上清液轉(zhuǎn)入無菌的1.5mLEppendorf管中，編號備用。6.1.3.4陽性對照：以滅活的口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)物作為陽性對照。6.1.3.5陰性對照：以滅菌雙蒸水作為陰性對照。6.2RT－PCR檢測6.2.1病毒RNA的提取6.2.1.1取n個新的經(jīng)DEPC水處理過的1.5mL滅菌Eppendorf管，其中n為被檢樣品、陰性對照、陽性對照的數(shù)量之和，編號。6.2.1.2每管加入750μL裂解液，然后分別加入處理過的被檢樣品、陰性對照、陽性對照各250μL，顛倒混勻，室溫靜置5min。6.2.1.3每管加入250μL氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15s（或混勻器上振蕩混勻15s室溫放置15min。6.2.1.44℃、12000g離心15min，取上層水相0.5mL于一新的經(jīng)DEPC水處理過的1.5mL滅菌Eppendorf管中，每管加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10min，4℃、12000g離心15min。6.2.1.5小心棄去上清液，倒置于吸水紙上，沾干液體，不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干，加入-20℃預(yù)冷的75%乙醇1mL，輕輕旋轉(zhuǎn)洗滌后于4℃、12000g離心10min。6.2.1.6小心棄去上清液，倒置于吸水紙上，沾干液體，不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干，室溫放置或真空干燥5～10min，不能過于干燥，以免降低RNA的溶解度。6.2.1.7每管加20μLDEPC水和1μLRNA酶抑制劑，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA70℃保存?zhèn)溆谩?.2.2RT－PCR擴(kuò)增6.2.2.1RT－PCR反應(yīng)體系組成（總體積25μL）42C4Sin95C3in擴(kuò)增條件為94C50s5BC50s,72C50s,35個循環(huán)后，72C延伸10in2——陰性對照5DB21/T2252—2014（規(guī)范性附錄） 試劑的配制A.11%溴化乙錠（EB）溶液溴化乙錠0.2g滅菌雙蒸水加至20mLA.2電泳緩沖液（50倍）A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二銨四乙酸二鈉（分析純）18.61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mLA.2.2TAE(三羥甲基氨基甲烷－乙酸)電泳緩沖液（50倍）羥基甲基氨基甲烷（Tris分析純）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）100mL滅菌雙蒸水加至1000mL用時用滅菌雙蒸水稀釋使用。A.31%瓊脂糖凝膠瓊脂糖（電泳級）TAE電泳緩沖液滅菌雙蒸水微波爐中完全融化，加溴化乙錠（EB）溶液20μL。4mLA.475%乙醇無水乙醇（分析純）滅菌DEPC水750mL250mLA.5滅菌DEPC水雙蒸水DEPC用磁力攪拌器室溫下持續(xù)攪拌過夜，分瓶包裝后121℃高壓滅菌25min。6DB21/T2252—2014A.6上樣緩沖液溴酚藍(lán)0.2g，加雙蒸水10mL過夜溶解，50g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚藍(lán)溶液中，搖勻定容至100mL。A.7電泳緩沖液（1倍）電泳緩沖液（50倍）滅菌雙蒸水490mLA.8磷酸鹽緩沖液的配制A.8.10.1mol/L磷酸鹽緩沖液氯化鈉（NaCl）80.0g氯化鉀（KCl）2.0g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12