手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案

手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案為規(guī)范手足口病的標(biāo)本采集、運(yùn)送及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作程序，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，從而為手足口病的明確診斷和相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的依據(jù)，特制定本方案。手足口病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)原則和程序手足口病的診斷一般是通過(guò)采集適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本后進(jìn)行病毒分離和病毒鑒定，如果沒(méi)有采到合適的臨床標(biāo)本，或無(wú)法進(jìn)行病毒分離，也可以通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)（如中和實(shí)驗(yàn)）來(lái)檢測(cè)血清中的中和抗體，或直接從臨床標(biāo)本中檢測(cè)病毒的核酸來(lái)診斷（見(jiàn)下圖：手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷流程圖）。一般是由省級(jí)病毒實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒的分離，爆發(fā)疫情范圍較大時(shí)，國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室也可以提供技術(shù)支持。病毒分離成功后，送至國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鑒定或復(fù)核，同時(shí)對(duì)全國(guó)手足口病的病原進(jìn)行病毒學(xué)監(jiān)測(cè)。國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室接到標(biāo)本后，在30日內(nèi)將結(jié)果反饋給省級(jí)實(shí)驗(yàn)室。很多血清型的腸道病毒能引起手足口病，不同細(xì)胞系對(duì)不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同時(shí)期腸道病毒的流行株也不同。通常用于腸道病毒分離的細(xì)胞系為RD細(xì)胞（對(duì)CA16和EV71敏感）、HEp-2細(xì)胞（對(duì)某些柯薩奇B組病毒敏感）等，聯(lián)合使用上述兩種或更多細(xì)胞（如Vero細(xì)胞）有助于分離到更多的腸道病毒。使用血清型特異性的中和抗血清進(jìn)行的中和實(shí)驗(yàn)是腸道病毒鑒定的基本方法，如果使用了適當(dāng)?shù)目寡澹瑢?shí)驗(yàn)結(jié)果是比較可靠的。因?yàn)槟c道病毒包括若干個(gè)血清型，通常使用組合抗血清進(jìn)行鑒定，有些組合抗血清已經(jīng)商品化。當(dāng)無(wú)法進(jìn)行病毒分離或得不到適用于病毒分離用的標(biāo)本時(shí)，血清學(xué)檢測(cè)可以為腸道病毒的感染提供一個(gè)間接的證據(jù)。一般用急性期血清及恢復(fù)期血清的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，抗體滴度呈四倍或以上增高證明有急性感染。但是，無(wú)癥狀的腸道病毒感染也是常見(jiàn)的，所以對(duì)檢測(cè)結(jié)果的解釋要慎重一些。為了提高檢測(cè)速度，也為了輔助中和實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行毒株鑒定，最近很多實(shí)驗(yàn)室都使用分子生物學(xué)方法。目前，用分子生物學(xué)方法對(duì)腸道病毒進(jìn)行定型還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，而且要根據(jù)檢測(cè)目的選擇使用適用的方法。檢測(cè)結(jié)果的評(píng)價(jià)如果從臨床標(biāo)本中分離到腸道病毒，尤其是分離自腦脊液、皰疹液，那么很可能該病毒就是病因病原。當(dāng)無(wú)法進(jìn)行病毒分離或未分離到病毒時(shí)，血清學(xué)診斷方法可以作為病毒感染的間接證據(jù)。對(duì)于難以分離到的腸道病毒，分子生物學(xué)方法如RT-PCR是很有用的。腸道病毒有時(shí)引起無(wú)癥狀感染，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際意義應(yīng)結(jié)合臨床過(guò)程和流行病學(xué)資料進(jìn)行解釋。實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)手、足、口等部位典型皮疹即可作出HFMD臨床診斷，流行病學(xué)接觸史有助于診斷，臨床診斷病例中符合下列之一，即為實(shí)驗(yàn)室診斷病例：1，患者的糞便標(biāo)本、咽拭子標(biāo)本中病毒分離陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于對(duì)照人群；2，腸道病毒型特異性中和抗體滴度≥1∶256；或恢復(fù)期血清中腸道病毒型特異性中和抗體較急性期有4倍或4倍以上增高；3，在病變組織中如皰疹液或腦脊液中分離到病毒；4，自患者血清、皰疹液或腦脊液等標(biāo)本中檢測(cè)到病原體核酸。

一、標(biāo)本采集對(duì)象標(biāo)本采集對(duì)象是暴發(fā)疫情出現(xiàn)時(shí)手足口病的臨床診斷病例和病例發(fā)病所在社區(qū)（村）的臨近無(wú)病例的社區(qū)（村）或托幼機(jī)構(gòu)的5歲以下的兒童（作為健康對(duì)照人群）。用于病毒分離的標(biāo)本包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，可以采集腦脊液標(biāo)本。對(duì)于血清學(xué)診斷，需要在急性期和恢復(fù)期采集雙份血清標(biāo)本。臨床標(biāo)本在運(yùn)輸和貯存過(guò)程中要避免反復(fù)凍融，如果不能確保-20℃的條件，應(yīng)該在0~8℃運(yùn)輸和保存。標(biāo)本應(yīng)冷凍運(yùn)輸，運(yùn)輸時(shí)要附有必要的信息，如標(biāo)本編號(hào)、發(fā)病日期和標(biāo)本采集日期。二、標(biāo)本種類及采集、運(yùn)送（一）糞便標(biāo)本采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。糞便標(biāo)本采集量5~8g/份，采集后立即放入無(wú)菌采便管內(nèi)，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。（二）咽拭子標(biāo)本采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3~5ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。4℃暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。（三）血清標(biāo)本采集急性期（發(fā)病0~3d）和恢復(fù)期（發(fā)病14~30d）雙份配對(duì)血清用于抗體檢測(cè)。靜脈采集3~5ml全血，置于真空無(wú)菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清置于－20℃以下冰箱中冷凍保存。（四）皰疹液在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液中分離到病毒具有很高的診斷價(jià)值，可同時(shí)采集多個(gè)皰疹作為一份標(biāo)本。先用75%的酒精對(duì)皰疹周圍的皮膚進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3~5ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標(biāo)本4℃暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。（五）腦脊液標(biāo)本出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，要采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病原和抗體檢測(cè)，從腦脊液中分離病毒也具有很高的診斷價(jià)值。采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.0~2.0ml。采集后立即裝入無(wú)菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。（六）病例密切接觸者的標(biāo)本采集選擇典型病例所在的托幼機(jī)構(gòu)、或所在村，以新發(fā)病例密切接觸者為采樣對(duì)象，采集單份糞便和血清標(biāo)本。（七）健康對(duì)照的標(biāo)本采集選擇患兒發(fā)病所在社區(qū)（村）的臨近無(wú)病例的社區(qū)（村）或托幼機(jī)構(gòu)。采集5歲以下的兒童單份糞便和血清標(biāo)本。三、標(biāo)本采集注意事項(xiàng)在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離病毒具有很高的診斷價(jià)值，但對(duì)于不同血清型的腸道病毒，腦脊液中的病毒分離率是大不相同的。用于采集咽拭子的無(wú)菌拭子要放在適當(dāng)?shù)谋４嬉褐?，如維持液或生理鹽水，以防干燥。用于分子生物學(xué)診斷的標(biāo)本采集及病毒分離標(biāo)本的采集方法一樣。為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測(cè)。不能立即檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)冷凍保存。對(duì)于血清學(xué)診斷，急性期血清應(yīng)該在發(fā)病后盡早采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病兩周后采集。四、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程（一）病毒分離1.試劑配置（1）細(xì)胞的生長(zhǎng)液、維持液的配制見(jiàn)下表生長(zhǎng)液（GM）維持液（MM）Eagle`s液(MEM)86.5ml92.5mlL-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5mlP.S溶液*(青霉素及鏈霉素)1.0ml1.0ml（2）糞便標(biāo)本的處理液完全PBS液中加入P．S溶液，終濃度為青霉素500單位/ml，鏈霉素為500μg/ml。2．病毒分離細(xì)胞系許多細(xì)胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CA16）生長(zhǎng)。對(duì)于檢測(cè)手足口病的病原來(lái)說(shuō)，建議所有懷疑含EV71、CA16的標(biāo)本均需接種到以下兩種細(xì)胞系：RD細(xì)胞，來(lái)源于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。HEp-2細(xì)胞，來(lái)源于人喉癌上皮細(xì)胞。3．標(biāo)本的處理（1）糞便標(biāo)本的處理操作步驟：1.1在離心管上標(biāo)記標(biāo)本號(hào)；1.2每管中加入10mlPBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；1.3在生物安全柜中將每一份糞便標(biāo)本取大約2g加入標(biāo)記好的離心管中（確保離心管上的標(biāo)號(hào)及原始標(biāo)本的標(biāo)號(hào)一致）；1.4剩余的原始標(biāo)本最好留在原容器中，凍存于－20℃；1.5確保擰緊離心管，用機(jī)械震蕩器劇烈震蕩20min；1.6在確保離心機(jī)的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機(jī)在1500g條件下離心20min；1.7在生物安全柜中將每一份標(biāo)本的上清液分別吸入2個(gè)有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應(yīng)再用氯仿處理一次）；1.8一管糞便懸液凍存于－20℃作為備份，另一管存于4~8℃以備接種。（2）皰疹液標(biāo)本的處理皰疹液標(biāo)本通常直接用于病毒分離。（3）腦脊液標(biāo)本的處理腦脊液標(biāo)本通常直接用于病毒分離。（4）咽拭子標(biāo)本的處理咽拭子要在標(biāo)本運(yùn)輸（保存）液中充分?jǐn)噭?dòng)（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，然后在4℃條件下，10000rpm離心20min，用上清接種到細(xì)胞上，如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，須用濾器過(guò)濾除菌。4．接種和觀察（病毒分離）（1）顯微鏡下觀察單層細(xì)胞，以確保細(xì)胞是健康的。一個(gè)健康的單層細(xì)胞會(huì)在傳代后3d左右形成；（2）倒掉生長(zhǎng)液（GM），換上1~1.2ml的維持液（MM）；（3）每一份標(biāo)本需要同時(shí)接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞，正確標(biāo)記每支細(xì)胞培養(yǎng)管（包括標(biāo)本的編號(hào)、日期、傳代數(shù)）；（4）每一種細(xì)胞至少標(biāo)記一管作為陰性對(duì)照；（5）每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度要求36℃（對(duì)于AHC標(biāo)本的病毒分離，尤其是EV70的分離培養(yǎng)，強(qiáng)烈建議降低培養(yǎng)溫度，一般可為34~35℃）；（6）使用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)（如細(xì)胞變圓，折光增強(qiáng)并脫離管壁等）；（7）記錄接種管和對(duì)照管細(xì)胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+~4+）、提示細(xì)胞受毒性反應(yīng)、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+，<25%;2+,25%~50%;3+,50%~75%;4+,75%~100%）；（8）如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)，要如實(shí)記錄，并觀察直到75%的細(xì)胞發(fā)生變化（3+CPE），然后儲(chǔ)藏在－20℃以備二次傳代。同一病例的二次傳代的病毒分離物可以放到一起用于進(jìn)一步的鑒定；（9）第1代培養(yǎng)見(jiàn)可疑細(xì)胞病變時(shí)繼續(xù)傳代，待細(xì)胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后－20℃或－70℃凍存；（10）一代陽(yáng)性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現(xiàn)，將病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于用一代病毒，所以選用二代病毒進(jìn)行鑒定。（11）如果7d之后沒(méi)有CPE出現(xiàn)，那么盲傳1代繼續(xù)觀察7d。（注意：同一病例標(biāo)本的細(xì)胞培養(yǎng)物不能混在一起再傳代，例如：不同細(xì)胞的培養(yǎng)物應(yīng)單獨(dú)傳代）；（12）盲傳2代后，仍然沒(méi)有出現(xiàn)CPE的，則判定為陰性；（13）注意：如果接種后24h內(nèi)出現(xiàn)CPE，很可能是標(biāo)本中的非特異性成分導(dǎo)致的毒性反應(yīng)。取100μl陽(yáng)性分離物傳二代，繼續(xù)觀察；或者在接種標(biāo)本吸咐1h后用維持液清洗細(xì)胞層，可能會(huì)降低毒性反應(yīng)。（14）幾個(gè)概念：A：毒性反應(yīng)：如果在接種后1~2d內(nèi)細(xì)胞快速地調(diào)亡，這可能是由于標(biāo)本中含有毒性物質(zhì)而導(dǎo)致的非特異性毒性反應(yīng)。這些已接種標(biāo)本的試管應(yīng)在－20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型細(xì)胞中（此時(shí)是第二代）。如果又出現(xiàn)了毒性反應(yīng)，那么應(yīng)該取原始標(biāo)本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細(xì)胞中。這時(shí)應(yīng)被認(rèn)為是第一代。B：微生物污染：由于細(xì)菌污染而造成培養(yǎng)液混濁或細(xì)胞死亡經(jīng)常使病毒造成的CPE無(wú)法確定或根本無(wú)法出現(xiàn)。重新取原始標(biāo)本，用氯仿處理，按上述步驟重新接種到新鮮細(xì)胞上。C：盲傳：有時(shí)一周之后傳代細(xì)胞會(huì)老化，甚至細(xì)胞對(duì)照也出現(xiàn)了病變。這時(shí)已接種標(biāo)本的試管應(yīng)在－20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型的新鮮單層細(xì)胞中，再觀察7~10d。如果盲傳兩代后仍然沒(méi)有產(chǎn)生CPE，那么認(rèn)為這個(gè)標(biāo)本是陰性的。5．病毒分離結(jié)果解釋：RD細(xì)胞支持HFMD的主要病原體——CA16和EV71的復(fù)制，CA16和EV71均能在RD細(xì)胞培養(yǎng)中引起特殊的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加，最后細(xì)胞自管壁脫落。但相同滴度的CA16和EV71在RD細(xì)胞中生長(zhǎng)的速度不同，EV71的生長(zhǎng)速度要快于CA16，表現(xiàn)為EV71感染RD細(xì)胞后出現(xiàn)CPE的時(shí)間比CA16早，EV71接種細(xì)胞后出現(xiàn)CPE很快，但CA16一般要經(jīng)過(guò)2次以上傳代才出現(xiàn)明顯的CPE。若在使用RD細(xì)胞分離的同時(shí)再增加HEp-2細(xì)胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其它可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。但CA16和EV71在HEp-2細(xì)胞中均不繁殖。從HFMD患兒的腦脊液、血液、皰疹液等臨床標(biāo)本中分離出病毒有診斷價(jià)值，但單從咽拭子或糞便中分離到病毒不能確診。從有上述臨床癥狀群患者的咽拭子或糞便中重復(fù)分離到同一型病毒，且從周圍患同樣疾病者中也檢出相同的病毒，且病毒分離率遠(yuǎn)高于正常人群，則有診斷的參考價(jià)值。（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度比較患者急性期血清及恢復(fù)期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學(xué)診斷方法，最常用的是中和實(shí)驗(yàn)，即用微量板法測(cè)定抗體滴度，是目前人腸道病毒抗體檢測(cè)的最常用方法，該方法精確且具有型特異性。作為腸道病毒感染的診斷方法之一，可以測(cè)定血清（或腦脊液）中腸道病毒中和抗體的滴度，通常用急性期血清及恢復(fù)期血清滴度進(jìn)行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是，不明顯的腸道病毒感染（隱性感染）也很常見(jiàn)，所以在評(píng)估檢測(cè)結(jié)果時(shí)就要小心一些。在中和實(shí)驗(yàn)中，一般要用人腸道病毒參考毒株（即原型株，EV71原型株為BrCr株，CA16原型株為G-10株），有時(shí)同時(shí)（或單獨(dú)）使用臨床分離株會(huì)有助于得到更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。使用對(duì)腸道病毒敏感的細(xì)胞，如RD細(xì)胞。用病毒（血清）稀釋液（下面液體配制中的C液，可用維持液代替）稀釋血清和制備病毒懸液，因?yàn)槭怯貌《緛?lái)確定血清（CSF）中抗體的滴度，所以要使用參考病毒（原型株），但有時(shí)使用所分離到的毒株（臨床分離株）有助于得到更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)然，分離株的滴度（100CCID50/0.05ml）要事先測(cè)定。中和實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)原理：病毒感染敏感靶細(xì)胞后，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），特異性中和抗體及病毒結(jié)合后，可使病毒顆粒失去感染性，抑制CPE的出現(xiàn)。1．液體配制A液：血清處理液：（100ml中含下列液體）MEM 85ml3%L-谷氨酰胺 1ml7.5%碳酸氫鈉 2ml胎牛血清 2ml青、鏈霉素（各10000U/ml） 10mlB液：細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液：（按生長(zhǎng)液配方配制，100ml中含下列液體）MEM 85ml3%L-谷氨酰胺 1ml7.5%碳酸氫鈉 2mlHEPES 1ml胎牛血清 10ml青、鏈霉素（各10000U/ml） 1mlC液：病毒（血清）稀釋液：（按維持液配方配制，100ml中含下列液體）MEM 93ml3%L-谷氨酰胺 1ml7.5%碳酸氫鈉 2mlHEPES 1ml胎牛血清 2ml青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml2．攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度制備（1）將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4℃、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于2支凍存管中，每管1.5ml，一般每管應(yīng)在一次試驗(yàn)中用完，有剩余者應(yīng)廢棄；（2）加Eagle液10倍系列稀釋為10-1至10-8病毒液，各加入細(xì)胞板內(nèi)，每孔50μl，每稀釋度4孔細(xì)胞；（3）每孔加細(xì)胞懸液50μl，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照（50μl稀釋液+50μl細(xì)胞懸液），36℃培養(yǎng)7d，觀察細(xì)胞病變；（4）按Behrens-K?rber公式計(jì)算出分離病毒株的CCID50；logCCID50=L-d(S-0.5)，其中：L=實(shí)驗(yàn)中使用的最低稀釋度的log值；d=稀釋梯度的log值；S=終判時(shí)陽(yáng)性部分的總和（即出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔所占的比例之和）。（5）正式試驗(yàn)前應(yīng)先滴定攻擊病毒2~3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100CCID50的病毒載量；（6）按照計(jì)算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗(yàn)所需的病毒總量（即100CCID50/0.05ml）；（7）取3支小試管，每只加病毒稀釋液（液體配制中的C液）0.9ml；（8）用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已經(jīng)稀釋好的攻擊病毒液（即10CCID50/0.05ml）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產(chǎn)生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1CCID50/0.05ml和0.1CCID50/0.05ml。3．稀釋血清（1）發(fā)病1~3d內(nèi)采取患者急性期血清，發(fā)病后2~4周采取恢復(fù)期血清，分別－20℃凍存?zhèn)錂z。（2）取無(wú)菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（上面液體配制中的A液）0.3ml，加待測(cè)血清0.1ml，蓋緊塞子，震搖混勻，放4℃冰箱過(guò)夜，即為1：4稀釋血清。次日56℃、30min滅活。（3）打開(kāi)獨(dú)立無(wú)菌包裝48孔組織培養(yǎng)板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（上面液體配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器取處理過(guò)的血清0.1ml加入第一孔（即為1：16），吹吸8~10次，吸0.1ml加入第二孔（即為1：64），依次至1：1024，血清稀釋的過(guò)程中不必?fù)Q吸尖。即每份血清標(biāo)本進(jìn)行4倍倍比稀釋，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。（4）每份血清標(biāo)本的每個(gè)稀釋度都要平行做兩孔。4．病毒中和抗體測(cè)定的操作步驟：（1）取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份（4對(duì)）待測(cè)血清，版面設(shè)計(jì)如下圖所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，不必?fù)Q吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）為每份待測(cè)血清對(duì)照孔，每孔中補(bǔ)加稀釋液0.05ml；（2）上述孔中分別加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已經(jīng)稀釋為100CCID50/0.05ml）；（3）蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36℃CO2孵箱中孵育2h；（4）另取一塊96孔板縱向使用，做100CCID50/0.05ml病毒滴度的核實(shí)（每次實(shí)驗(yàn)都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C液）0.05ml，然后從0.1CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每個(gè)稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100CCID50/0.05ml；同時(shí)留出4孔做為細(xì)胞對(duì)照孔，每孔加入0.1ml病毒稀釋液，然后放入4℃冰箱中暫存；（5）在孵育期間，用消化液消化細(xì)胞，準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液的濃度為2×105個(gè)/ml，每塊96孔板至少需要準(zhǔn)備10ml；（6）孵育結(jié)束后每個(gè)待測(cè)血清孔、血清對(duì)照孔（待檢標(biāo)本板）和病毒回滴孔和細(xì)胞對(duì)照孔（病毒回滴板）分別加入0.1ml細(xì)胞懸液，然后用微量板混勻器混勻，放入36℃CO2孵箱中孵育培養(yǎng)；（7）使用倒置顯微鏡每天觀察CPE，并記錄病毒滴定結(jié)果，以不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清最高稀釋度的倒數(shù)為終點(diǎn)效價(jià)。當(dāng)100CCID50/0.05ml的病毒對(duì)照孔出現(xiàn)完全病變時(shí)，判定最終結(jié)果（約5~7d）；（8）注意：如果病毒對(duì)照結(jié)果（病毒回滴）不在32~320CCID50/0.05ml的范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)無(wú)效，就要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。5．結(jié)果判定：當(dāng)最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，另一孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，該稀釋度的倒數(shù)計(jì)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)兩個(gè)相鄰稀釋度血清均出現(xiàn)1孔細(xì)胞病變，另1孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)。對(duì)于HFMD的雙份血清中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)，如果恢復(fù)期血清較急性期血清EV71或CA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復(fù)期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高可證實(shí)該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽(yáng)性。（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）1．RNA提取可使用商業(yè)化試劑盒來(lái)提取RNA，如使用QIAGENViralRNAMiniExtractionKit（CAT：52904）從臨床標(biāo)本或病毒分離培養(yǎng)物中提取病毒RNA；（1），向一支1.5ml離心管中加入560μl的AVL緩沖液（含CarrierRNA）；（2），再向這支離心管中加入140μl臨床標(biāo)本或病毒分離培養(yǎng)物，充分混勻至少15s；（3），室溫下（15℃~25℃）放置10min，然后瞬時(shí)離心；（4），加入560μl純酒精，充分混勻至少15s，瞬時(shí)離心；（5），小心加入約630μl的混合溶液至QIAamp柱中（試劑盒附帶），將QIAamp柱套在收集管上，然后8000rpm離心5s，使液體通過(guò)濾膜；（6），棄去收集管中的液體，重復(fù)第6步驟；（7），棄去收集管中的液體，小心加入750μl的AW1緩沖液，8000rpm離心5s，使液體通過(guò)濾膜；（8），棄去收集管中的液體，小心加入750μl的AW2緩沖液，8000rpm離心5s，使液體通過(guò)濾膜；（9），棄去收集管中的液體，13000rpm再次離心1min；（10），將QIAamp柱放入一支干凈的1.5ml的離心管中；（11），向膜上加入40μl的EB緩沖液，然后室溫下靜置2~5min；（12），在離心機(jī)中以8000rpm的速度離心1min，離心下來(lái)的液體即為所需的核酸溶液。2．RT-PCR擴(kuò)增（1）引物序列合成1）人腸道病毒（包括EV71、CA16）核酸檢測(cè)通用引物序列：PE2（上游）：5`-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3`PE1（下游）：5`-ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTCC-3`2）EV71核酸檢測(cè)引物序列：EV71-S（上游）：5`-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3`EV71-A（下游）：5`-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3`3）CA16核酸檢測(cè)引物序列：CoxA16-S（上游）：5`-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3`CoxA16-A（下游）；5`-TCAGTGTTGGCAGCTGTAGG-3`（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1）在PCR記錄紙（實(shí)驗(yàn)記錄紙）上記錄本次實(shí)驗(yàn)操作者姓名，實(shí)驗(yàn)日期，所鑒定標(biāo)本的名稱以及標(biāo)本的順序，及PCR儀排列的順序一致。2）標(biāo)記好加標(biāo)本和對(duì)照的PCR管（陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照和試劑對(duì)照）。A：陽(yáng)性對(duì)照：無(wú)感染性的對(duì)照RNA。B：細(xì)胞對(duì)照：使用未接種病毒的細(xì)胞懸液，最好使用及擴(kuò)增病毒所用的細(xì)胞類型及代數(shù)相同的細(xì)胞。每一次實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)細(xì)胞對(duì)照。C：試劑對(duì)照：用去離子水代替標(biāo)本。（3）RT-PCR擴(kuò)增1）在冰面上融化病毒標(biāo)本和各種PCR試劑；2）配下列試劑主溶液：10×PCRBuffer···································································5.0μldNTPs（2.5mMeach）·······················································2.0μl上游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl下游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μlRNA酶抑制劑（RNasin,40U/μl）······································0.5μlTaqDNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶（10U/μl）··················································1.0μl模板RNA·······································································