2025版高考生物二輪復習課件 第一部分 專題九 爭分點突破2 基因工程

基因工程爭分點突破2

一

核心提煉1.限制酶的選擇技巧(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點選擇限制酶①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇限制酶SmaⅠ。②為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和反向連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也能被切出相同的黏性末端，如圖乙)。(2)根據(jù)質粒的特點選擇限制酶(如圖)(3)根據(jù)Ti質粒的T－DNA片段選擇限制酶。圖中甲、乙、丁Ti質粒均不宜選取，而丙Ti質粒宜選取(假設切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)。2.基因表達載體的構建過程(如圖)3.Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)(1)Cre重組酶：由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼，具有限制酶特性，能夠特異性識別LoxP位點。能介導兩個LoxP位點之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。(2)LoxP序列：來源于P1噬菌體，包括兩個13bp的反向重復序列和一個8bp的間隔區(qū)域，反向重復序列是Cre重組酶的特異識別位點，而間隔區(qū)域決定了LoxP位點的方向。(3)①同向LoxP：如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列，僅保留一個LoxP。②反向LoxP：如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導致兩個LoxP位點間的序列倒位。4.CRISPR/Cas9基因編輯CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細菌體內的用來對抗侵略細菌的外源DNA或噬菌體的基因編輯系統(tǒng)。CRISPR是成簇的、規(guī)律間隔的、短回文重復DNA序列。Cas9蛋白是一種RNA引導的DNA內切核酸酶，當細菌受到噬菌體的侵染時，噬菌體的某段DNA序列被Cas9內切酶剪切后整合到CRISPR的間隔序列區(qū)域，當相同種類的噬菌體再次侵染細菌時，轉錄的crRNA可以引導Cas9蛋白找到并切斷噬菌體(形成平末端)釋放到細菌體內的DNA，從而阻止噬菌體在細菌體內繁殖。其作用機制大體可以分為三個步驟：(1)內切酶(Cas9酶)切割噬菌體獲取新的間隔序列；(2)將其引入原間隔序列并轉錄出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成復合物精準切割與新間隔序列相同的基因。具體過程如圖所示。5.In－Fusion技術In－Fusion技術即無縫克隆和組裝技術，是一種新型的、快速、簡潔的克隆方法，可以在質粒的任何位點進行一個或多個目標DNA片段的插入。具體原理：在載體末端和目的基因兩端應具有15～25個同源堿基，而目的基因兩端的同源序列往往是通過引物設計實現(xiàn)的，In－Fusion酶能夠識別具有相同末端序列的線性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA連接酶再將兩條DNA單鏈黏合起來。(1)質粒構建過程：①采用酶切或者PCR擴增方法將載體線性化；②使用設計好的引物進行目的DNA片段的PCR擴增；③反應體系內形成重組質粒。(2)與傳統(tǒng)酶切、酶連相比的優(yōu)勢：①位點選擇靈活，在載體任意位置進行基因克??；②快速簡便；③克隆效率高，陽性克隆高達90%以上；④可同時克隆兩個或多個DNA片段。判斷下列關于基因表達載體構建的敘述(1)基因表達載體上的啟動子是DNA聚合酶識別和結合的部位，而終止子是使翻譯過程在需要的地方停下來(

)提示：基因表達載體上的啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，用于驅動基因的轉錄；終止子使轉錄過程在所需要的地方停下來?！?2)基因表達載體具有多個限制酶切點，有助于目的基因的表達，而復制原點的作用是保證標記基因在宿主細胞中復制并穩(wěn)定保存(

)提示：載體具有多個限制酶切點，以便構建基因表達載體；復制原點可以保證重組DNA分子在受體細胞中能自我復制?！?3)在果實中表達acs(乙烯合成關鍵酶基因)的反義基因可延遲果實成熟(

)(4)利用蛋白質工程技術在腈水合酶(N0)的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩(wěn)定的融合型腈水合酶(N1)，加入連接肽需要通過改造基因實現(xiàn)(

)√√(5)“DNA粗提取與鑒定”實驗中，在DNA溶液中加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍色(

)提示：將DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺試劑，沸水浴加熱五分鐘，待冷卻后，溶液呈現(xiàn)藍色?！?6)“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，離心研磨液是為了加速DNA的沉淀(

)提示：“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，離心研磨液是為了加速細胞碎片的沉淀?！?7)粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，向過濾后所得濾液中加入與濾液體積相等的、體積分數(shù)為95%的冷卻的酒精后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物(

)×提示：向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，向過濾后所得濾液中加入與濾液體積相等的、體積分數(shù)為95%的冷卻的酒精，此時DNA析出，不會進入濾液中。二

真題演練1.(2024·全國甲，38節(jié)選)質粒載體上有限制酶a、b、c的酶切位點，限制酶的切割位點如圖所示。構建重組質粒時，與用酶a單酶切相比，用酶a和酶b雙酶切的優(yōu)點體現(xiàn)在_____________________________________________________________(答出兩點即可)；使用酶c單酶切構建重組質粒時宜選用的連接酶是_______________。避免目的基因和質粒的反向連接、防止目的基因和質粒的自身環(huán)化T4DNA連接酶2.(2023·全國乙，38節(jié)選)GFP是水母體內存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白。科研人員以GFP基因為材料，利用基因工程技術獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白?？蒲腥藛T從構建的GFP突變基因文庫中提取目的基因(均為突變基因)構建表達載體，其模式圖如圖所示(箭頭為GFP突變基因的轉錄方向)。圖中①為________；②為________，其作用是____________________________________________________；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標記基因，其作用是___________________________________________________________________。終止子啟動子RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA

鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來3.(2022·福建，13節(jié)選)載體和CD14片段的酶切位點及相應的酶切抗性基因序列如圖所示。用XhoⅠ和SalⅠ分別酶切CD14和圖中載體連接，CD14接入載體時會形成正向連接和反向連接的兩種重組DNA?？蛇M一步用這兩種限制酶對CD14的連接方向進行鑒定，理由是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。

正向連接的重組DNA有這兩種酶切位點(限制酶的識別序列)；而反向連接的重組DNA會形成新的序列，沒有這兩種酶的酶切位點(沒有限制酶的識別序列)4.(2024·新課標，35節(jié)選)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細菌(B1)的基因組中，構建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結合位置、片段甲替換區(qū)如圖所示，→表示引物5′→3′方向?；卮鹣铝袉栴}：(1)限制酶切割的化學鍵是____________。為保證N基因能在菌株B2中表達，在構建片段甲時，應將M1與M2片段分別插入質粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點之間，原因是__________________________________________________________________________。磷酸二酯鍵

不破壞N基因，使M1與M2之間有啟動子、N基因、終止子，能保證N基因正常表達(2)CRISPR/Cas9技術可以切割細菌B1基因組中與向導RNA結合的DNA。向導RNA與B1基因組DNA互補配對可以形成的堿基對有G－C和____________________。C－G、A－T、U－A5.(2024·湖南，21節(jié)選)百合具有觀賞、食用和藥用等多種價值，科研人員對其進行了多種育種技術研究。研究人員從野生百合中獲得一個抵抗尖孢鐮刀菌侵染的基因L，該基因及其上游的啟動子pL和下游的終止子結構如圖a。圖b是一種Ti質粒的結構示意圖，其中基因gus編碼GUS酶，GUS酶活性可反映啟動子活性。(1)研究病原微生物對L的啟動子pL活性的影響。從圖a所示結構中獲取pL，首先選用_________________酶切，將其與相同限制酶酶切的Ti質粒連接，再導入煙草。隨機選取3組轉基因成功的煙草(P1、P2和P3)進行病原微生物脅迫，結果如圖c。由此可知：三種病原微生物都能誘導pL的活性增強，其中_________的誘導作用最強。HindⅢ、BamHⅠ交鏈格孢根據(jù)目的片段以及質粒上限制酶的識別位點，若要獲得啟動子pL并連接到質粒上，可選用限制酶HindⅢ、BamHⅠ進行酶切，以替換Ti質粒中的啟動子，從而達到根據(jù)GUS酶活性反映啟動子活性的目的。根據(jù)圖c的結果可知，交鏈格孢處理的每一組轉基因煙草中的GUS酶活性都最高，可確定其誘導作用最強。(2)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)栽培種百合B中也有L，但其上游的啟動子與野生百合不同，且抗病性弱。若要提高該百合中L的表達量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種，簡要寫出實驗思路：_____________________________________________________________________。利用轉基因技術將百合B中基因L的啟動子替換為野生百合中基因L的啟動子pL欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種，可利用轉基因技術將百合B中基因L的啟動子替換為野生百合中基因L的啟動子pL。6.(2023·海南，20節(jié)選)我國開發(fā)了一種新型基因遞送系統(tǒng)(切—浸—生芽，簡稱CDB法)。圖1與圖2分別是利用常規(guī)轉化法和CDB法在某植物中遞送基因的示意圖。則：(1)圖1與圖2中，農桿菌侵染植物細胞時，可將外源基因遞送到植物細胞中的原因是________________________________________________________

農桿菌細胞內含有Ti質粒，Ti質粒中的T－DNA能將外源基因遞送到植物細胞中，并與植物細胞的染色體DNA整合到一起___________________________________________________。(2)已知某酶(PDS)缺失會導致植株白化。某團隊構建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體(含有綠色熒光蛋白標記基因)，利用圖2中的CDB法將該重組載體導入植株B，長出毛狀根，成功獲得轉化植株B。據(jù)此分析，從毛狀根中獲得陽性毛狀根段的方法是______________________________________，圖2中，鑒定導入幼苗中的基因編輯載體是否成功發(fā)揮作用的方法是___________________________，依據(jù)是____________________________________________________________________________________。熒光檢測選擇帶有綠色熒光標記的毛狀根觀察幼苗是否表現(xiàn)出白化特征致植株白化，白化苗的出現(xiàn)意味著通過基因編輯技術成功實現(xiàn)PDS基因的敲除PDS缺失會導三

模擬預測1.研究人員將靛藍色素酶基因(IDG)與啟動子PTL12(棉纖維細胞特異啟動子)相連以構建基因表達載體(如圖，KpnⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ代表不同限制酶，圖中質粒上酶的位置為其對應的酶切位點)，并最終培育出能在棉纖維細胞中表達靛藍色素酶的彩色棉新品種。本研究中將IDG與啟動子PTL12結合的主要目的是______________________________________________________________________________________________。PTL12是棉纖維細胞特異啟動子，將IDG與特異啟動子PTL12結合可以使IDG基因在棉纖維細胞中特異表達過程①②都使用KpnⅠ切割質粒，目的是__________________________________________________________________________________。形成相同的黏性末端，使PTL12片段能與IDG按設計方向正確連接，保證IDG的正確表達2.(2024·天津寧河區(qū)高三一模)藍細菌中的ictB蛋白能高效轉運和濃縮CO2，從而提高細胞光合速率。我國科學家構建了葉片特異性啟動子Cab(葉綠體捕光色素蛋白Cab基因啟動子)驅動的藍細菌ictB基因表達載體，并通過農桿菌轉化法獲得了轉ictB基因水稻，大大提高了水稻的產量。在ictB基因表達載體的構建中，含Cab啟動子和ictB基因的重組DNA分子和Ti質粒的酶切位點如圖1所示。請回答下列問題：(1)為使重組DNA分子能定向插入T－DNA中，可用PCR的方法在重組DNA分子兩端添加限制酶識別序列，據(jù)圖可知，M端添加的序列所對應的限制酶是________，N端添加的序列所對應的限制酶是________。添加了限制酶識別序列的重組DNA分子與Ti質粒的重組過程共需要______種酶。Bgl

ⅠEcoRⅤ4據(jù)圖1可知，重組DNA分子中有BamHⅠ的酶切位點，故不能選擇BamHⅠ，又因為Sau3AⅠ也可識別BamHⅠ的酶切位點，故也不能選擇Sau3AⅠ，又由于Spe

Ⅰ能切割Cab啟動子，也不能選擇，故只能選擇Bgl

Ⅰ和EcoRⅤ，再根據(jù)啟動子的方向可知，M端添加的序列所對應的限制酶是Bgl

Ⅰ，N端添加的序列所對應的限制酶是EcoRⅤ；添加了限制酶識別序列的重組DNA分子與Ti質粒的重組過程共需要4種酶，分別是Bgl

Ⅰ、EcoRⅤ、DNA連接酶和Sau3AⅠ(切割Ti質粒)。_____________________________________。檢測應選用的植物器官是______，原因是_________________________________________________________________。(2)將農桿菌液浸泡過的水稻愈傷組織進行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入________進行篩選，最終獲得多個水稻株系a1、a2、a3、a4。對a1～a4四個水稻株系的ictB蛋白表達量進行測定，結果如圖2，其中a4株系ictB蛋白表達量較低的原因可能是_________潮霉素a4水稻株葉片系中沒有導入目的基因或目的基因未表達Cab啟動子是葉片特異性啟動子，它使ictB基因只能選擇性地在葉片中表達由圖1可知潮霉素抗性基因位于Ti質粒的T－DNA上，隨T－DNA整合到水稻細胞的染色體上，所以將農桿菌液浸泡過的水稻愈傷組織進行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入潮霉素進行篩選，篩選出的愈傷組織可再分化形成叢芽，最終獲得多個轉基因水稻株系；蛋白質的表達量與基因的表達有關，故a4株系ictB蛋白表達量較低的原因可能是其沒有導入目的基因或目的基因沒有表達。由于Cab啟動子是葉片特異性啟動子，它使ictB基因只能選擇性地在葉片中表達，故檢測應選用的植物器官是葉片。3.隨著土壤鹽漬化(主要是Na＋引起)不斷加劇，提高耐鹽性已成為研究和改良作物的重要方向。從高鹽環(huán)境中吸收K＋可維持細胞內K＋/Na＋穩(wěn)態(tài)，從而提高植物的耐鹽性。H是細胞膜上的一種K＋轉運蛋白，B蛋白可以增強H的功能。為探究作用機理，研究人員構建了兩個分別含有CFP－B和YFP－H融合基因的表達載體。CFP和YFP分別是青色熒光蛋白基因和黃色熒光蛋白基因。為了獲得含CFP－B的表達載體，選擇了已經包含CFP的載體p1300－CFP。相關信息如圖所示。請回答下列問題：(1)為將B基因連入CFP基因，需使用兩端帶有酶切位點序列的引物擴增B基因，優(yōu)先選擇的酶切位點是________________，理由是___________________________________________________________________________________。BamHⅠ和Pst

ⅠBsrGⅠ在CFP基因中存在，不能使用；雙酶切可避免目的基因和載體自身環(huán)化和反向連接(2)據(jù)此，研究人員使用的兩條引物序列分別為5′－XXXXXXNNATGGCCGGC－3′和5′－YYYYYYCTACTCAGA－3′。X和Y分別代表(1)選擇的酶切位點，N代表任意堿基的核苷酸。第一條引物中NN的作用是___________________________________________________________________。

使得CFP與B基因之間的堿基個數(shù)為3的倍數(shù)，翻譯時B基因不發(fā)生移碼第二條引物與圖中B基因末端序列不相同的原因是____________________________________________________________________________________________________________。用同樣的方法獲得了含YFP－H融合基因的表達載體。

第一條引物與模板鏈配對，序列與圖示B基因序列相同，第二條引物與非模板鏈配對，序列應與圖示B基因序列互補4.通過體內同源重組可以進行靶向基因敲除，原理如圖1所示。同源重組技術結合tetr－sacB雙重選擇系統(tǒng)可對基因進行敲除與回補，研究基因的功能。圖2是科研人員利用該方法對大腸桿菌LacZ基因進行敲除與回補的相關過程，其中tetr是四環(huán)素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表達產物能將無色化合物X－gal水解成藍色化合物。限制酶EcoRⅠBamHⅠHindⅢXma

Ⅰ識別序列和切割位點↓5′—GAATTC—3′

↓5′—GGATCC—3′

↓5′—AAGCTT—3′

↓5′—CCCGGG—3′回答下列問題：(1)據(jù)圖1分析，與傳統(tǒng)轉基因技術相比，體內同源重組具有的特點是_____________________________。無需使用限制酶和DNA連接酶(2)圖2過程①中，設計兩種引物時需在引物5′端分別添加________、________限制酶的識別序列；過程⑤中，設計兩種引物時需在引物5′端分別添加________基因兩端的同源序列。(3)圖2過程⑦中，在含有_______________的培養(yǎng)基中出現(xiàn)了白色菌落，即為篩選出的敲除LacZ基因菌株。過程⑧通過同源重組技術結合tetr－sacB雙重選擇系統(tǒng)可對LacZ基因進行回補，篩選LacZ基因回補菌株時應在培養(yǎng)基中添加______________。EcoRⅠBamHⅠLacZ四環(huán)素和X－gal蔗糖和X－gal5.PMP22基因在人基因組中有多個拷貝，表達產生的PMP22蛋白在人髓鞘細胞中不可或缺，但PMP22蛋白過量可引發(fā)腓骨肌萎縮癥(CMT1A)，科研人員希望利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)治療CMT1A?；卮鹣铝袉栴}：(1)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)原理如圖1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA雙鏈，造成DNA損傷，一次切割過程中會產生____個游離的磷酸基團。機體修復DNA損傷時，可能會改變堿基序列。圖中gRNA的作用是___________________________________。2定向引導Cas9蛋白與靶向基因結合(2)科研人員本來的基因編輯方案是將gRNA結合位點設計在PMP22基因內部，后改為如圖2所示的方案，該方案比起原方案的優(yōu)點是_________________________________________________________________________________________________。既能專一性切除多余的PMP22基因，又能確保必要的PMP22基因不被破壞，比破壞PMP22基因結構更可靠(3)科研人員希望在人髓鞘細胞中表達CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，構建的基因表達載體如圖3所示。①在對gRNA對應的DNA片段進行PCR擴增時，需要在上游和下游引物的5′端分別添加堿基序列__________________和__________________，保證DNA片段定向插入。②基因表達載體上，除了圖示序列和標記基因外，還需要的序列是_________。5′－GTCGAC－3′5′－GGATCC－3′Cas9基因為保證不破壞復制原點，DNA上游需添加Sal

Ⅰ的識別序列；由于Xho

Ⅰ與Sal

Ⅰ為同尾酶，為避免目的基因與載體任意連接，DNA下游需添加BamHⅠ的識別序列。6.(2024·青島高三二模)某種雄性不育水稻是由野生型水稻的核基因M突變?yōu)閙所致，科研團隊構建轉基因智能不育系的思路是將育性恢復基因OsNP1(在原始生殖細胞中表達)、花粉失活基因ZM－AA(在花粉中表達)兩個基因一起構建重組Ti質粒。然后通過農桿菌轉化法將目的基因導入愈傷組織細胞，從轉基因后代中篩選m位點是純合但兩個轉基因位點是雜合的可育植株。(1)圖1為已導入ZM－AA基因的重組Ti質粒，圖2為OsNP1基因和相應的酶切位點，其中A鏈為轉錄模板鏈。為使OsNP1基因與圖1中Ti質粒正確連接來構建基因表達載體，應選擇的酶有_____________________________；采用PCR技術擴增圖2中的OsNP1基因時，會出現(xiàn)長、中、短三種長度的單鏈，一個OsNP1基因在第n次循環(huán)中新合成的短鏈數(shù)為_______。BamHⅠ、HindⅢ和DNA連接酶2n－2圖1重組Ti質粒的啟動子和終止子之間含有三種酶的酶切位點，即EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ，而圖2OsNP1基因兩端的酶切位點為EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ，EcoRⅠ酶切會導致目的基因和Ti質粒自身環(huán)化和反向連接，為使OsNP1基因與圖1中Ti質粒正確連接來構建基因表達載體，應選擇的酶是BamHⅠ、HindⅢ和DNA連接酶。PCR技術擴增會出現(xiàn)長、中、短三種長度的單鏈，分別代表模板鏈、引物鏈(第一次擴增形成的)、新合成的短鏈；一個OsNP1基因在n－1次循環(huán)中共形成2n－1個DNA分子、形成2n個DNA單鏈，而這些單鏈中只有模板鏈不會新合成短鏈，則第n次循環(huán)中新合成短鏈的數(shù)目＝2n－2。(2)重組Ti質粒中的新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的具體作用分別是_________________________________、_______________________________。篩選出導入目的基因的愈傷組織細胞篩選出導入重組Ti質粒的農桿菌新霉素抗性基因作為標記基因，用于篩選含有目的基因的受體細胞(愈傷組織細胞)；卡那霉素抗性基因作為選擇標記基因，用于篩選含有重組Ti質粒的農桿菌。(3)若使兩個基因分別在不同的細胞中表達，需將兩個基因分別與_____________________________________________重組在一起。在特定細胞中特異性表達的基因啟動子等調控元件四

專題強化練12345678910111213答案對一對題號12345678910答案ADACCBCABCACDBD題號11答案(1)低256(或44)

GTTT

CAAT(或CAAT

GTTT)

(2)卡那霉素SacⅠ

④

(3)1/412345678910111213對一對題號

12答案(1)Cla

Ⅰ

Mun

Ⅰ

(2)4

P4與A擴增產物不含完整的WAP基因的啟動子，EPO基因不表達(3)能使EPO基因在大鼠的乳腺細胞中特異性表達(4)EPO基因是真核生物的基因，該基因轉錄出的mRNA無法在大腸桿菌細胞內加工成熟，表達出來的產物不是EPO題號13答案(1)DNA聚合酶和DNA連接酶引物F13′端序列(2)BclⅠ和SmaⅠ

①④

(3)先篩選出能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長而不能在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長的農桿菌，再用含草甘膦的培養(yǎng)基篩選出導入融合基因的擬南芥細胞(4)根促進植物對磷元素的吸收答案1.(2024·江西，12)γ-氨基丁酸在醫(yī)藥等領域有重要的應用價值。利用L-谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脫羧是高效生產γ-氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產菌株E.coliA，構建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是A.圖示表明，可以從釀酒酵母S

中分離得到目的基因gadBB.E.coliB發(fā)酵生產γ-氨基丁酸時，

L-谷氨酸鈉的作用是供能C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質?！?2345678910111213答案由圖示可知，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB，A正確；由題干可知，E.coliB以L-谷氨酸鈉為底物高效生產γ-氨基丁酸，因此L-谷氨酸鈉為反應底物，而不是起供能作用，B錯誤；E.coli

A和E.coliB均為生產γ-氨基丁酸的菌種，故二者均不能高效降解γ-氨基丁酸，C錯誤；根據(jù)題干及題圖給出的信息，無法推斷出是否有其他酶能夠替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質粒，D錯誤。12345678910111213答案2.(2024·永州高三模擬)自然界中很少出現(xiàn)藍色的花，天然藍色花出現(xiàn)的主要原因是花瓣細胞液泡中的花青素在堿性條件下顯藍色。我國科學家利用鏈霉菌的靛藍合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構建了基因表達載體(如圖)，通過農桿菌轉化法將上述基因導入白玫瑰，在細胞質基質中形成穩(wěn)定顯色的靛藍。下列相關敘述正確的是A.不同限制酶的識別序列都是由6個脫

氧核苷酸組成的B.將idgS基因插入Ti質粒時使用的限制

酶是SpeⅠ和BamHⅠC.將sfp基因插入Ti質粒時使用的限制酶是PmeⅠ和SacⅠD.啟動子和終止子不表達出蛋白質，都屬于基因的調控序列√12345678910111213答案大多數(shù)限制酶的識別序列由6個脫氧核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的脫氧核苷酸組成，A錯誤；由圖可以看出，idgS基因插入Ti質粒的SpeⅠ和SacⅠ兩個限制酶識別位點之間，sfp基因插入Ti質粒的啟動子1和終止子1之間；將sfp基因插入Ti質粒時，可使用限制酶BamHⅠ，將idgS基因插入Ti質粒時，可用SpeⅠ和SacⅠ進行雙酶切割，B、C錯誤；啟動子和終止子不表達出蛋白質，都屬于基因的調控序列，D正確。12345678910111213答案3.由于PCR擴增出的目的基因末端為平末端，且無合適的限制酶識別序列，需借助中間載體P將目的基因接入載體E。圖示為兩種載體的結構和相關限制酶的識別序列，下列敘述正確的是A.構建重組載體P時，應選擇EcoRⅤ進

行酶切，再用T4DNA連接酶連接B.為了便于該目的基因接入載體E，可

用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割載體PC.載體P不能作為基因表達載體，是因

為它不含起始密碼子和終止密碼子D.若受體細胞表現(xiàn)出抗性基因的相應性狀，表明重組載體成功導入受體細胞√12345678910111213答案由于載體E只有產生黏性末端的酶切位點，要使中間載體P接入載體E，同時防止載體E自身環(huán)化，需要用兩種限制酶分別切割載體E和中間載體P，據(jù)圖可知，中間載體P和載體E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶識別序列，故可選用XhoⅠ和PstⅠ酶進行酶切，載體P的這兩種酶識別序列中含有EcoRⅤ識別位點，并且其切割產生平末端，可以用于連接目的基因，SmaⅠ酶雖然也能切割得到平末端，但是其識別位點沒有位于XhoⅠ和PstⅠ酶識別位點之間，故不能選擇其對中間載體P進行切割，連接平末端用T4DNA連接酶，A正確，B錯誤；12345678910111213答案由圖可知，不直接選擇P構建表達載體是因為它不含啟動子與終止子，C錯誤；受體細胞表現(xiàn)出抗性基因的相應性狀，可能是導入了重組質粒，也可能只導入了空質粒(不含目的基因的質粒)，D錯誤。12345678910111213答案4.目的基因和載體如果用同一種限制酶處理，連接時會出現(xiàn)正反接的情況，為鑒定篩選出的表達載體中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR后，結合電泳技術鑒定，圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，其中目的基因為長度300bp的片段。下列有關說法錯誤的是A.PCR復性溫度不宜太低，避免引物錯配和模板鏈

形成雙鏈B.電泳條帶遷移的位置和速度與DNA分子的大小和

構象有關C.選取引物甲、丙，擴增出450bp長度片段時，可以說明目的基因正接D.選取引物甲、乙，擴增出400bp長度片段時，可以說明目的基因反接12345678910111213答案√復性是在高溫解旋后降低溫度讓引物與模板鏈結合，復性溫度不宜太低，避免引物錯配和模板鏈形成雙鏈，A正確；電泳條帶遷移的位置和速度與DNA分子的大小和構象有關，電泳一段時間后，較大的DNA分子遷移距離小，離加樣孔近，而較小的DNA分子遷移距離大，離加樣孔遠，B正確；12345678910111213答案由于使用的引物是甲和丙，沒有與基因相應位置配對，因此不管目的基因正接還是反接，擴增出的片段均為450bp，C錯誤；選取引物甲和乙，擴增出400bp長度片段時，可以說明目的基因反接，若正接，不能擴增出100bp的片段，D正確。12345678910111213答案5.普通棉花中β-甘露糖苷酶基因表達出的GhMnaA2能催化半纖維素降解，使棉纖維長度變短。為了培育長絨棉，科研人員構建了反義GhMnaA2基因表達載體(將正義GhMnaA2基因與載體反向連接)，獲得了轉基因長絨棉新品種，具體過程如圖所示，圖中SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ代表相應的酶切位點。用SmaⅠ和NotⅠ切割某正義表達載體可獲得3kb、18kb、28kb、59kb4種長度的DNA片段。下列敘述正確的是A.正義GhMnaA2基因的轉錄方向是B→AB.過程①得到的表達載體均為反義表達載體C.反義GhMnaA2基因可能通過抑制GhMnaA2

基因的翻譯來保證棉纖維長度D.用NotⅠ切割反義表達載體獲得的DNA片段

的長度為21kb和87kb√12345678910111213答案由圖可知，反義表達載體中，反義GhMnaA2基因轉錄方向是B→A，則正義GhMnaA2基因的轉錄方向是A→B，A錯誤；由于只能由SmaⅠ來構建反義表達載體，因此過程①得到的表達載體可能為反義表達載體，也可能為正義表達載體，B錯誤；12345678910111213答案反義GhMnaA2基因轉錄出來的RNA與正常轉錄的mRNA互補，從而阻止其與核糖體結合，即反義GhMnaA2基因可能通過抑制GhMnaA2基因的翻譯來保證棉纖維長度，C正確；12345678910111213答案用SmaⅠ和NotⅠ切割正義表達載體可獲得3kb、18kb、28kb、59kb4種長度的DNA片段，據(jù)此判斷左側SmaⅠ和NotⅠ之間的長度是59kb，A位置處SmaⅠ和NotⅠ之間的長度是3kb，B位置處SmaⅠ和NotⅠ之間的長度是18kb，右上角E6位置處SmaⅠ和NotⅠ之間的長度是28kb，故用NotⅠ切割反義表達載體獲得的DNA片段的長度應分別為18＋28＝46(kb)和3＋59＝62(kb)，D錯誤。12345678910111213答案6.雙向啟動子可同時結合兩個RNA聚合酶來驅動下游基因的表達，研究人員構建了圖示表達載體，以檢測雙向啟動子作用效果。下列分析不正確的是A.可用農桿菌轉化法將構建好

的表達載體導入植物細胞B.為連入GUS基因，需用SalⅠ

和SphⅠ酶切已整合了雙向

啟動子及LUC基因的質粒C.在培養(yǎng)基中添加壯觀霉素可篩選出成功導入該表達載體的微生物受體細胞D.可通過觀察是否出現(xiàn)熒光和藍色物質確認雙向啟動子的作用√12345678910111213答案將基因表達載體導入植物細胞常用的方法是農桿菌轉化法，A正確；如果用SphⅠ酶切已整合了雙向啟動子及LUC基因的質粒時就會破壞LUC基因，B錯誤；如果成功導入含有壯觀霉素抗性基因的基因表達載體，受體細胞就具有抗壯觀霉素的能力，在含有壯觀霉素的培養(yǎng)基上能生存，因此可以篩選出成功導入表達載體的微生物受體細胞，C正確；雙向啟動子如果正常表達，就會合成熒光素酶和β-葡萄糖苷酶，二者催化底物分別產生熒光或生成藍色物質，從而確定雙向啟動子的作用，D正確。12345678910111213答案7.(2024·常德高三三模)研究人員將目的基因插入質粒，構建重組質粒的過程如圖所示，再將該重組質粒導入大腸桿菌中。由β-半乳糖苷酶基因編碼產生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal產生藍色物質，使菌落呈藍色，否則菌落為白色。下列敘述錯誤的是A.將目的基因插入質粒中時，需要用到的

酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA連接酶B.需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一

種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)C.將按圖示構建的重組質粒導入大腸桿菌

后，大腸桿菌可正常表達該目的基因D.在含X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)導入了重組質粒的大腸桿菌，可出現(xiàn)藍色菌落12345678910111213答案√目的基因兩側含有限制酶XhoⅠ、NheⅠ的識別序列，將目的基因插入質粒中時，需要用到限制酶XhoⅠ、NheⅠ切割目的基因和質粒，再用DNA連接酶將目的基因和質粒連接在一起，A正確；將目的基因導入受體細胞時，需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)，B正確；12345678910111213答案將按圖示構建的重組質粒導入大腸桿菌后，由于目的基因的轉錄方向和啟動子的方向相反，大腸桿菌不能正常表達該目的基因，C錯誤；在含X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)導入了重組質粒的大腸桿菌，β-半乳糖苷酶基因編碼產生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal產生藍色物質，使菌落呈藍色，D正確。12345678910111213答案8.(不定項)(2024·德州高三二模)CRISPR/Cas9基因編輯技術能對基因進行定點編輯，其原理如圖1所示?？蒲腥藛T根據(jù)豬的細胞表面抗原基因RAG1的啟動子設計了sgRNA1和sgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得了兩種基因敲除豬，檢測基因敲除豬體內的RAG1基因表達情況如圖2所示。下列說法正確的是12345678910111213答案12345678910111213答案A.CRISPR/Cas9識別目標DNA序列主要與sgRNA序列的特異性相關B.基因敲除豬的細胞表面抗原減少，器官移植過程中免疫排斥作用減弱C.兩種sgRNA都可引導Cas9在轉錄水平上減弱RAG1基因的表達D.據(jù)圖2可知，用sgRNA2制備的基因敲除豬用于器官移植效果更好√√√CRISPR/Cas9識別目標DNA序列主要與sgRNA編碼序列有關，即主要與sgRNA序列的特異性相關，A正確；豬的細胞表面抗原會導致器官移植時發(fā)生免疫排斥，基因敲除豬的細胞表面抗原減少，器官移植過程中免疫排斥作用減弱，提高了器官移植的成功率，B正確；12345678910111213答案轉錄是以DNA的一條鏈為模板合成RNA的過程，啟動子是RNA聚合酶識別與結合的位點，用于驅動基因的轉錄，科研人員根據(jù)豬的細胞表面抗原基因RAG1的啟動子設計了sgRNA1和sgRNA2，故兩種sgRNA都可引導Cas9在轉錄水平上減弱RAG1基因的表達，C正確；12345678910111213答案據(jù)圖2可知，與對照組相比，用sgRNA1制備的基因敲除豬RAG1基因表達量更低，說明用sgRNA1制備的基因敲除豬用于器官移植效果更好，D錯誤。12345678910111213答案9.(不定項)(2024·永州高三一模)Cre/LoxP系統(tǒng)能實現(xiàn)特定基因的敲除(如圖1)。把幾種熒光蛋白基因和Cre酶能識別并切割的序列(LoxP1和LoxP2)串在一起，構建表達載體T(如圖2)。部分熒光蛋白基因會被Cre酶隨機“剪掉”，且兩個LoxP1之間或兩個LoxP2之間的基因，最多會被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表達，隨機呈現(xiàn)不同的顏色。下列說法正確的是A.Cre酶切下一個待敲除基因的過程，

需要破壞四個磷酸二酯鍵B.若小鼠細胞含一個表達載體T(不含

Cre酶)，其肌肉組織細胞呈紅色C.若小鼠細胞含一個表達載體T(含Cre酶)，其腦組織細胞呈紅色或黃色或藍色D.若小鼠細胞含兩個表達載體T(含Cre酶)，其一個腦組織細胞內可能隨機出現(xiàn)兩種顏色√12345678910111213答案√√12345678910111213答案DNA單鏈上相鄰的兩個脫氧核苷酸之間通過磷酸二酯鍵相連，DNA由兩條單鏈螺旋纏繞形成，Cre酶切下一個待敲除基因的過程中，需要切斷基因前后兩端，因此需要破壞四個磷酸二酯鍵，A正確；據(jù)圖可知，小鼠有編碼紅、黃、藍熒光蛋白的基因，前端有腦組織特異性表達的啟動子，肌肉細胞不會表達顏色基因，故若小鼠細胞含一個表達載體T(不含Cre酶)，其肌肉組織細胞呈無色，B錯誤；12345678910111213答案小鼠腦組織細胞內有2個相同表達載體T(含Cre酶)，Cre酶對每個DNA片段隨機剪切，因而細胞的顏色由細胞內兩種熒光蛋白的顏色疊加而成，故其腦組織細胞可能隨機出現(xiàn)兩種顏色，D正確。10.(不定項)(2024·青島高三二模)TaIBH1－2D是小麥中一個調控千粒重的關鍵基因。為驗證TaIBH1－2D的功能，研究人員構建了過表達株系，可利用酶切法檢驗TaIBH1－2D與載體是否連接，圖1三個泳道分別是用不同的限制酶完全酶切后(只考慮圖示酶切位點)，產物經瓊脂糖凝膠電泳的結果；同時構建了敲除TaIBH1－2D基因的突變體。圖2統(tǒng)計了不同植株的千粒重。下列說法正確的是12345678910111213答案A.電泳的緩沖液中含指示劑，可在紫外燈下被檢測出來B.泳道1為單酶切空載體，泳道2為單酶切的重組載體C.泳道3為雙酶切的重組載體，且目的基因與載體正確連接D.由圖2分析，TaIBH1－2D負調控小麥千粒重√12345678910111213答案√載樣緩沖液中的指示劑指示電泳進程，核酸染料加在凝膠中，凝膠中的DNA分子經過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，A錯誤；12345678910111213答案泳道1和泳道2均出現(xiàn)一個條帶，說明這兩個條帶都是單酶切得到的，因為重組載體單酶切后的長度大于空載體，泳道1的條帶長度小于泳道2，則泳道1為單酶切空載體，泳道2為單酶切的重組載體，B正確；12345678910111213答案泳道3有一個條帶的大小與泳道1相同，且還有兩個較小的條帶，則泳道3為限制酶A和限制酶B雙酶切的重組載體，由于目的基因的兩側都有限制酶A的酶切位點，所以無法判斷目的基因與載體是否正確連接，C錯誤；12345678910111213答案分析圖2，TaIBH1－2D基因過表達株系的千粒重小于野生型和敲除突變體的，說明TaIBH1－2D負調控小麥千粒重，D正確。12345678910111213答案11.(2024·山東，25)研究發(fā)現(xiàn)基因L能夠通過脫落酸信號途徑調控大豆的逆境響應。利用基因工程技術編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaⅠ切點處插入大豆基因L的向導DNA序列，將載體導入大豆細胞后，其轉錄產物可引導核酸酶特異性結合基因組上的目標序列并發(fā)揮作用。載體信息、目標基因L部分序列及相關結果等如圖所示。12345678910111213答案LB/RB：T－DNA的邊界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；Ampr氨芐青霉素抗性基因。甲載體信息12345678910111213答案乙目標基因L部分序列丙限制酶識別序列、切割位點及電泳結果(1)用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目標基因L時，所用的引物越短，引物特異性越____(填“高”或“低”)。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上可產生的黏性末端最多有_________種。載體信息如圖甲所示，經BsaⅠ酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5′－______________－3′和5′－______________－3′。12345678910111213答案低256(或44)GTTT(或CAAT)CAAT(或GTTT)單鏈突出序列NNNN為黏性末端，N代表任意堿基，所以，用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上能得到256種黏性末端。載體上有2個BsaⅠ酶切位點，最后兩個空序列為GTTT和CAAT，方向均從5′到3′。12345678910111213答案12345678910111213答案(2)重組載體通過農桿菌導入大豆細胞，使用抗生素_________篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點如圖乙所示，PCR產物完全酶切后的電泳結果如圖丙所示。據(jù)圖可判斷選用的限制酶是_______，其中純合的突變植株是______(填序號)?？敲顾豐acⅠ④導入大豆細胞中的T－DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，因此可以通過使用卡那霉素篩選到具有該抗生素抗性的植株。根據(jù)圖甲可知，目標基因L的目標序列跟突變序列之間的差異只有在SacⅠ酶切位點上存在差異，BamHⅠ和EcoRⅠ這兩個酶切位點完全相同，12345678910111213答案根據(jù)圖丙及題意可知，要以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，并對PCR產物完全酶切后進行電泳從而判斷植株含有的是目標序列還是突變序列，因此只能選用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突變序列存在酶切位點，但是目標序列沒有，因此經過該酶酶切后突變序列的電泳條帶會出現(xiàn)兩條，目標序列是一條，根據(jù)圖丙結果可知，只有④為純合的突變植株。12345678910111213答案(3)實驗中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測發(fā)現(xiàn)其體細胞中只有1條染色體有T－DNA插入。用抗生素篩選這個植株的自交子代，其中突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例為_____，篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育。12345678910111213答案1/4根據(jù)題意可知，在實驗中獲得了一株基因L成功突變的純合植株，已知該植株具有抗生素抗性，經過檢測卻發(fā)現(xiàn)其體細胞中只有1條染色體有T－DNA插入。根據(jù)圖示可知，抗生素抗性基因在T－DNA片段上，因此如果用抗生素來篩選該植株進行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例為1/2，不含T－DNA(對抗生素敏感)的配子比例為1/2，因此突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例應該為1/2×1/2＝1/4，篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育。12345678910111213答案12.(2024·岳陽高三期末)人促紅細胞生成素(EPO)是一種可用于治療腎性貧血的糖蛋白類激素，可用乳腺生物反應器生產EPO?？蒲腥藛T利用大12345678910111213答案鼠乳清酸蛋白(WAP)基因上游的調控序列及啟動子和3′UTR序列構建了基因表達載體。構建前，科研人員擴增了WAP基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入EPO基因中，以確定WAP基因啟動子的具體位置。相關信息如圖所示，回答下列問題：12345678910111213答案(1)為將擴增后的產物定向插入基因表達載體中，以指導EPO基因的表達，需要在引物末端添加特定的限制酶識別序列。由圖中信息可知，在P1～P4末端添加的序列所對應的限制酶是______，在A末端添加的序列所對應的限制酶是_______。ClaⅠMunⅠ需要將WAP基因上游的調控序列及啟動子和3′UTR序列與EPO基因相連，則擴增的WAP基因上游的調控序列及啟動子和3′UTR序列的5′端不能含有目的基因上的酶切位點，則P1～P4末端添加的序列所對應的限制酶是ClaⅠ，WAP基因上游的調控序列及啟動子和3′UTR序列的3′端需要與EPO基因相連，但是不能破壞EPO基因序列，也不能破壞WAP基因上游的調控序列及啟動子和3′UTR序列，則A末端添加的序列所對應的限制酶是MunⅠ。12345678910111213答案有EPO生成。含P4與A擴增產物的個體沒有EPO生成的原因是___________________________________________________________。12345678910111213答案(2)將通過PCR處理后的含不同長度的WAP基因上游序列與EPO基因連接，構建成表達載體的過程中，需要____種限制酶切割上述DNA片段。檢測轉基因雌性大鼠時發(fā)現(xiàn)，導入含P1～P3與A擴增產物的個體乳汁中有EPO，而含P4與A擴增產物的個體沒4P4與A擴增產物不含完整的WAP基因的啟動子，EPO基因不表達需要用兩種限制酶切割WAP基因上游的調控序列及啟動子和3′UTR序列，用兩種限制酶切割EPO基因，所以共需要4種限制酶切割上述DNA片段。P4與A擴增產物不含完整的WAP基因的啟動子，EPO基因不表達，則含P4與A擴增產物的個體沒有EPO生成。12345678910111213答案(3)該實驗中，在EPO基因上游插入大鼠WAP基因啟動子的理由是___________________________________________。能使EPO基因在大鼠的乳腺細胞中特異性表達12345678910111213答案啟動子具有組織特異性，大鼠WA