2025版高考生物二輪復(fù)習(xí)課件 易錯(cuò)點(diǎn)12 雙標(biāo)記基因載體

雙標(biāo)記基因載體易

錯(cuò)點(diǎn)12[名師支招]1.雙標(biāo)記基因載體的作用

雙標(biāo)記基因載體具有兩個(gè)標(biāo)記性狀，如四環(huán)素抗性和青霉素抗性，在基因表達(dá)載體的構(gòu)建中會(huì)破壞其中一個(gè)，如破壞四環(huán)素抗性，含有目的基因的基因表達(dá)載體此時(shí)只有青霉素抗性，而空載體依然具有四環(huán)素抗性和青霉素抗性，通過在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，可以區(qū)分出含有目的基因的載體和空載體。2.雙標(biāo)記原理 (1)單標(biāo)記的區(qū)分問題：僅有一個(gè)標(biāo)記基因時(shí)，含有目的基因的載體和空載體都有標(biāo)記，在篩選時(shí)無(wú)法區(qū)分。(2)雙標(biāo)記方法：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果目的基因插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖所示，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。篩選方法：將細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長(zhǎng)的是含重組載體的細(xì)菌和含空載體的細(xì)菌，如圖中1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布將上述5個(gè)菌落影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如上圖，能生長(zhǎng)的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的即為含有目的基因的菌落，如圖中1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。提醒①標(biāo)記基因本身也是一個(gè)能正常表達(dá)的基因，具有自己的啟動(dòng)子和終止子。②受體細(xì)胞不同，標(biāo)記基因種類也不同；受體細(xì)胞為細(xì)菌時(shí)，標(biāo)記基因通常是抗生素抗性基因；受體細(xì)胞為真核細(xì)胞，尤其是動(dòng)植物細(xì)胞時(shí)，抗生素很多時(shí)候不能殺死未標(biāo)記的細(xì)胞，無(wú)法起到篩選的效果，此時(shí)標(biāo)記基因通常選擇熒光基因等。[典例賞析]1.(2024·山東青島期末)研究人員將大麥細(xì)胞的LTP1基因?qū)虢湍钢?，讓酵母產(chǎn)生LTP1蛋白。下圖為該實(shí)驗(yàn)過程的部分流程。下列說法正確的是(

)BA.運(yùn)用PCR擴(kuò)增LTP1基因時(shí)，應(yīng)選擇圖1的A和D作為引物B.為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，可在引物5′端添加限制酶的識(shí)別序列C.篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的啤酒酵母時(shí)，只需配制含青霉素的培養(yǎng)基D.為了讓大麥的基因在酵母中表達(dá)，需要在目的基因兩側(cè)添加大麥的啟動(dòng)子和終止子解析

DNA復(fù)制子鏈延伸的方向只能從5′端到3′端，也就是DNA聚合酶只能從引物的3′端延伸DNA鏈，由圖可知，構(gòu)建前利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，應(yīng)選取B和C作為引物，A錯(cuò)誤；為構(gòu)建目的基因和質(zhì)粒連接的重組質(zhì)粒，往往需要在引物5′端適當(dāng)增加限制酶識(shí)別序列方便切割，B正確；由圖可知，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，四環(huán)素抗性基因被破壞，而青霉素抗性基因沒有被破壞，因此將導(dǎo)入C的酵母菌分別在含有青霉素和四環(huán)素的兩種選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則在含有青霉素的培養(yǎng)基上能存活，但在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能存活的才是導(dǎo)入重組質(zhì)粒的啤酒酵母，C錯(cuò)誤；為了讓大麥的基因在酵母中表達(dá)，需要在目的基因上游添加酵母的啟動(dòng)子，下游添加酵母的終止子，D錯(cuò)誤。2.(2024·江蘇海安高級(jí)中學(xué)聯(lián)考)熒光蛋白(GFP)在紫外光下會(huì)發(fā)出綠色熒光，某科研團(tuán)隊(duì)將GFP基因插入質(zhì)粒P中構(gòu)建了重組質(zhì)粒載體P0，用于基因工程中基因表達(dá)載體(P1)的篩選和鑒定。部分過程如圖所示，如表為部分限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)?；卮鹣铝袉栴}：(1)過程①中用EcoRⅤ酶切獲得的目的基因具有________末端，過程②表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，前提是要根據(jù)________________________設(shè)計(jì)出引物。(2)過程③中，質(zhì)粒P0需用限制酶________切割，與擴(kuò)增出的目的基因在__________酶作用下形成P1。平目的基因的一段核苷酸序列BamHⅠDNA連接(3)為了篩選出含有質(zhì)粒P1的菌落，需采用添加________的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在紫外光下____________________的菌落，為含有P1的菌落。(4)提取經(jīng)上述篩選所得菌落的RNA，通過________獲得DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若最終未能檢測(cè)出目的基因，可能的原因是___________________________。進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)需先加熱至90～95℃，加入引物后冷卻至55～60℃，以上調(diào)控溫度操作的目的分別是__________________、________________________。四環(huán)素不發(fā)出綠色熒光逆轉(zhuǎn)錄目的基因未能在受體菌中轉(zhuǎn)錄使DNA解聚為單鏈?zhǔn)挂锱c互補(bǔ)DNA鏈結(jié)合解析

(1)由表格可知，用EcoRⅤ酶切獲得的目的基因具有平末端。過程②表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，需要根據(jù)目的基因的一段核苷酸序列設(shè)計(jì)出引物。(2)由圖可知，構(gòu)建P1時(shí)，限制酶Sau3AⅠ會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因(標(biāo)記基因)，而EcoRⅤ會(huì)破壞復(fù)制原點(diǎn)，可選擇BamHⅠ切割，與擴(kuò)增出的目的基因在DNA連接酶作用下形成P1。(3)為了篩選含有質(zhì)粒P1的菌落，由于標(biāo)記基因是四環(huán)素抗性基因，所以需采用添加了四環(huán)素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在紫外光下，由于BamHⅠ破壞了GFP基因，所以選擇不發(fā)出綠色熒光的菌落，為含有P1的菌落。(4)所得菌落的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若最終未能檢測(cè)出目的基因，可能的原因是目的基因未能在受體菌中轉(zhuǎn)錄。當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈，溫度下降到50