儀器分析 (第三版 魏培海)第一章 紫外可見分光光度法

章紫外可見分光光度法利用物質(zhì)對紫外可見光的吸收特征和吸收強(qiáng)度，對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的一種儀器分析方法。在化工、醫(yī)藥、冶金、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。2021/6/271“十二五”職業(yè)教育國家規(guī)劃教材儀器分析（第三版）魏培海曹國慶主編2021/6/272第一章紫外可見分光光度法“十二五”職業(yè)教育國家規(guī)劃教材2021/6/273了解紫外可見吸收光譜的產(chǎn)生理解化合物電子能級(jí)躍遷的類型和特點(diǎn)熟悉紫外可見分光光度計(jì)的工作原理掌握光吸收定律的應(yīng)用及測量條件的選擇掌握紫外可見分光光度法在定量分析中的應(yīng)用知識(shí)目標(biāo)2021/6/274能解釋物質(zhì)產(chǎn)生的顏色能操作常見的紫外可見分光光度計(jì)能應(yīng)用紫外可見分光光度法進(jìn)行物質(zhì)的定量分析能力目標(biāo)2021/6/275第一節(jié)基本原理一、光的基本特性二、光與物質(zhì)的作用三、光譜吸收曲線四、光吸收定律2021/6/276一、光的基本特性1．光的波動(dòng)性光具有波動(dòng)性：光的折射、衍射和干涉等;光屬于電磁波(電磁輻射)，可在真空中傳輸;

光速(真空中)：c=2.997×108m?s-1。2021/6/277描述參數(shù)頻率ν(赫茲，Hz)：每秒內(nèi)振動(dòng)的次數(shù)波長λ(m，cm，μm，nm)：相鄰兩個(gè)波峰或波谷間的直線距離波數(shù)σ(cm-1)：每厘米內(nèi)波的振動(dòng)次數(shù)2021/6/278電磁波譜電磁輻射按波長順序排列稱為電磁波譜2021/6/2792021/6/27102．光的粒子性光具有粒子性:光電效應(yīng)光由光子(光量子)組成:光子具有能量光子的能量與光的頻率或波長有關(guān):

E:焦耳(J)或電子伏特(eV)1eV=1.602×10-19Jh:普朗克常數(shù)6.626×10-34J·s

2021/6/2711【例1-1】試計(jì)算波長為400nm的電磁輻射的能量。分別用焦耳和電子伏特表示。解：2021/6/2712思考

試比較波譜區(qū)各種輻射的能量大小。2021/6/27132．單色光、復(fù)合光和互補(bǔ)色光

單色光：具有同一波長（或頻率）的光。復(fù)合光：由不同波長的光組合而成的光；

復(fù)合光可分離出單色光。可見光：能被肉眼感受到的光；波長范圍：400～780nm。

2021/6/2714日光：復(fù)合白光，由紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等各種色光按一定比例混合而成。2021/6/2715互補(bǔ)色光：如果兩種適當(dāng)顏色的光按一定強(qiáng)度比例混合得到白光，則這兩種顏色的光稱為互補(bǔ)色光。2021/6/27162021/6/2717二、光與物質(zhì)的作用光的發(fā)射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等。反射、折射、干涉、衍射等過程中，光的傳播方向發(fā)生改變，但光與物質(zhì)之間沒有能量的傳遞。2021/6/27181．光的吸收特點(diǎn)：在光的吸收過程中，光與物質(zhì)之間會(huì)產(chǎn)生能量的傳遞。

微觀過程：能級(jí)躍遷。M(基態(tài),E0)+hν

M*(激發(fā)態(tài),Ej)

光吸收的條件：

ΔE=Ej-E02021/6/2719【例1-2】〗某分子中兩個(gè)電子能級(jí)之間的能級(jí)差為1eV，若要電子在兩個(gè)能級(jí)之間發(fā)生躍遷，需要吸收光的波長為多少nm？如果能級(jí)差為20eV，波長應(yīng)為多大？

解：對應(yīng)能量的波長分別為：2021/6/2720由上述例題得出什么結(jié)論？結(jié)論：物質(zhì)對光的吸收具有選擇性。2021/6/27212.物質(zhì)顏色的產(chǎn)生

如果完全吸收各種波長的光，則呈黑色；如果完全反射即沒有光的吸收，則呈白色；如果選擇性吸收了某些波長的光，則呈現(xiàn)的顏色與其反射或透過的光的顏色有關(guān)。

光學(xué)現(xiàn)象：當(dāng)一束白光照射到固體物質(zhì)時(shí)2021/6/2722如果各種顏色的光透過的程度相同，則溶液無色透明；如吸收了某種波長的光，則溶液呈現(xiàn)的是它吸收的光的互補(bǔ)色。光學(xué)現(xiàn)象：當(dāng)一束白光照射到溶液時(shí)2021/6/2723完全吸收完全透過吸收黃光2021/6/2724物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色與吸收光的對應(yīng)關(guān)系2021/6/2725三、光譜吸收曲線

1.紫外可見吸收光譜產(chǎn)生的機(jī)理

分子內(nèi)的三種運(yùn)動(dòng)形式電子運(yùn)動(dòng):在不同分子軌道上；原子核之間的相對振動(dòng)；分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)。2021/6/2726分子內(nèi)的三種能級(jí)電子能級(jí)：Ee振動(dòng)能級(jí):Ev轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)：ErΔE2021/6/2727

在光吸收受過程中，基于分子中電子能級(jí)的躍遷而產(chǎn)生的光譜，稱為紫外—可見吸收光譜。紫外-可見吸收光譜2021/6/27282.光譜吸收曲線

用一連續(xù)波長的光以波長大小順序分別照射分子，測定物質(zhì)分子對各種波長光的吸收程度（用吸光度A表示）。實(shí)驗(yàn)測量：數(shù)據(jù)處理：

以波長(λ)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到A～λ關(guān)系曲線，即光譜吸收曲線，通常稱為吸收光譜。2021/6/2729λmax吸收峰峰谷肩峰

250300350400λ/nm1234A末端吸收特征：曲線形狀峰的數(shù)目峰的位置峰的強(qiáng)度2021/6/2730圖1-3KMnO4水溶液的吸收曲線。其中（a）、（b）、（c）對應(yīng)的濃度分別為：1.4×10-2、2.8×10-2、5.6×10-2g/L。2021/6/2731同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同；同一物質(zhì)不同濃度的溶液，曲線形狀相似，但一定波長處的吸光度隨溶液的濃度增加而增大。物質(zhì)定量分析的依據(jù)；不同物質(zhì)吸收曲線的特性不同，與物質(zhì)特性有關(guān)。物質(zhì)定性分析的依據(jù)。

譜線討論2021/6/2732四、光吸收定律

光的吸收程度與光通過物質(zhì)前后的光的強(qiáng)度變化有關(guān)。2021/6/27331.光強(qiáng)度、透光率和吸光度

術(shù)語定義符號(hào)光強(qiáng)度單位時(shí)間(s)、單位面積(1cm2）上輻射光的能量，與光子的數(shù)目有關(guān)。I0:入射It:透射透光率透射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值（It/I0）T吸光度透光率的負(fù)對數(shù)-lg(It/I0）A吸光系數(shù)單位濃度、單位厚度是物質(zhì)的吸光度,a

2021/6/2734討論T:0.00％～100.0％。T=0.00%表示光全部被吸收；T=100.0%表示光全部透過。A:0.00～∞。A=0.00表示光全部通過；A→∞表示光全部被吸收。2021/6/2735

當(dāng)一束平行單色光垂直通過溶液時(shí)，溶液對光的吸收程度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。k為比例常數(shù)；b的單位為cm。

2.朗伯-比爾吸收定律2021/6/2736k的討論k的物理意義：液層厚度為1cm的單位濃度溶液，對一定波長光的吸光度。k愈大，表示吸收光的能力愈強(qiáng)，分光光度測定的靈敏度就愈高。k的單位及數(shù)值還與濃度采用的單位有關(guān)。濃度單位k的單位名稱符號(hào)定量關(guān)系mol·L-1L·mol-1·cm-1摩爾吸光系數(shù)εε=aMM：物質(zhì)的摩爾質(zhì)量g·L-1L·g-1·cm-1質(zhì)量吸光系數(shù)a2021/6/27373.應(yīng)用條件入射光必須為單色光；被測樣品必須是均勻介質(zhì)；在吸收過程中，吸收物質(zhì)之間不能發(fā)生相互作用。

2021/6/2738應(yīng)用范圍即適于紫外光、可見光，也適于紅外光；即適于均勻非散射的液態(tài)樣品，也適于微粒分散均勻的固態(tài)或氣態(tài)樣品；即可用于單組分分析，也可用于多組分的同時(shí)，測定吸光度具有加和性。

2021/6/2739【例1-3】已知某化合物的分子量為251，用乙醇作溶劑將此化合物配成濃度為0.150mmol/L的溶液，在480nm波長處用2.00cm吸收池測得透光率為39.8%，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)ε及質(zhì)量吸光系數(shù)a?！窘狻恳阎猚=0.150×10-3mol/L，b=2.00cm，

T=0.398摩爾吸光系數(shù)：

質(zhì)量吸光系數(shù)：

2021/6/27404.朗伯-比爾定律的偏離現(xiàn)象

2021/6/2741朗伯-比爾定律的局限性:濃度不高的溶液；非單色入射光引起的偏離:

儀器因素；溶液本身發(fā)生化學(xué)變化引起的偏離

。

原因2021/6/2742第二節(jié)化合物的紫外可見光譜一、有機(jī)化合物的紫外可見光譜二、無機(jī)化合物的紫外可見光譜

2021/6/2743

光譜產(chǎn)生:由構(gòu)成分子的原子的外層價(jià)電子躍遷所產(chǎn)生;

電子躍遷:與分子的組成、結(jié)構(gòu)以及溶劑等因素有關(guān)。一、有機(jī)化合物的紫外可見光譜

2021/6/27441．電子躍遷的類型

分子軌道類型

成鍵軌道：σ軌道、π軌道；

反鍵軌道：σ*軌道、π*軌道；

非鍵軌道：n軌道。

圖示

2021/6/2745

電子類型

成鍵電子：σ電子、π電子；

非鍵軌道：n電子。

電子吸收光能，由低能極軌道躍遷到高能極軌道。

np

COHH2021/6/2746

n**n→*→*n→*→*電子躍遷過程示意2021/6/2747→*

發(fā)生范圍：所有有機(jī)化合物；

吸收光波長：<200nm；n→*

發(fā)生范圍：含N、O、S、P和鹵素原子的有機(jī)化合物；

吸收光波長：200nm附近；2021/6/2748→*

發(fā)生范圍：含有不飽和鍵的有機(jī)化合物；如:C=C、C≡C

吸收光波長：

200nm附近；n→*

發(fā)生范圍：含有不飽和雜原子基團(tuán)的有機(jī)化合物；既有鍵又有孤對電子；如：-C=O、-NO2,

吸收光波長：

近紫外區(qū)甚至可見去；2021/6/2749電荷轉(zhuǎn)移躍遷

發(fā)生范圍：具有電子給予體和電子接受體化合物；

吸收光波長：

近紫外區(qū)甚至可見區(qū)；NR1R2hvNR1R2+電子接受體電子給予體2021/6/27502．常用術(shù)語

生色團(tuán)

定義：含有π鍵的結(jié)構(gòu)單元

舉例：

>C＝C<、—C≡C—、>C＝O

—N＝N—、—N＝O、—C≡N

電子躍遷：π→π*或n→π*躍遷2021/6/2751助色團(tuán)

定義：含有未共用電子對的雜原子基團(tuán)

舉例：

—NH2

、—OH、—NR2

、—OR—SH、—SR、—Cl、—Br

作用原理：

本身無生色功能，與生色團(tuán)相連時(shí)，基團(tuán)中的n電子與生色團(tuán)中的π電子發(fā)生n—π共軛作用，使π→π*躍遷能量降低，躍遷概率變大，增強(qiáng)生色團(tuán)的生色能力，使吸收波長向長波方向移動(dòng)。2021/6/2752紅移和藍(lán)移

紅移：使化合物的吸收峰向長波長方向移動(dòng)的現(xiàn)象。不飽和鍵之間的共軛效應(yīng)、引入助色團(tuán)或改變?nèi)軇┑臉O性，都會(huì)引起紅移現(xiàn)象。

藍(lán)移：使化合物的吸收峰向短波長方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為藍(lán)移（或紫移）。改變?nèi)軇┑臉O性會(huì)引起藍(lán)移現(xiàn)象。

2021/6/27533．影響紫外可見吸收光譜的因素

（1）共軛效應(yīng)（2）容劑效應(yīng)（3）溶液pH2021/6/2754共軛效應(yīng)

兩個(gè)或兩個(gè)以上不飽和鍵共軛時(shí)，由于共軛后π電子的運(yùn)動(dòng)范圍增大，引起π*軌道的能量降低，π—π*躍遷的能級(jí)差ΔE減小，吸收光譜產(chǎn)生紅移，同時(shí)摩爾吸光系數(shù)增大。2021/6/2755化合物溶劑λmax/nmεmax/L/mol·cmCH2＝CH－(CH2)－CH3己烷17711800CH2＝CHCH2CH2CH＝CH2異辛烷17826000CH2＝CH－CH＝CH2己烷21721000CH2＝CH－CH＝CH－CH＝CH2異辛烷268430002021/6/2756溶劑效應(yīng)

使用的溶劑不同，同一種物質(zhì)得到的光譜可能不一樣。溶劑異辛烷氯仿甲醇水π—π*λmax/nm235238237243n—π*λmax/nm321315309305溶劑對異丙叉丙酮紫外吸收光譜的影響

極性增加2021/6/2757

n

p

非極性極性

n>

pn→

*躍遷：藍(lán)移；；

→

*躍遷：紅移；；非極性極性

n

n

p

n<

pn2021/6/2758溶液pH

不同pH的溶液中，分子或離子的解離形式可能發(fā)生變化，其吸收光譜的形狀、λmax和吸收強(qiáng)度可能不一樣。

測定這些化合物的紫外可見光譜時(shí)，須注意溶液的pH。2021/6/27594．常見有機(jī)化合物的紫外可見吸收光譜

只能生σ→σ*躍遷，λ～150nm?？勺鳛闇y定紫外－可見光譜時(shí)的溶劑。引入雜原子，可產(chǎn)生n→σ*躍遷，吸收波長變大。如：CH3I、CH3Br、CH3Cl、CH4的λmax分別為259nm、204nm、173nm、125nm。電負(fù)性越小，λmax越大。飽和烴及其取代衍生物2021/6/2760產(chǎn)生σ→σ*和π→π*躍遷。π→π*躍遷吸收光波長大，有實(shí)用價(jià)值。共軛烯烴，因共軛效應(yīng)產(chǎn)生紅移，共軛體系越大，吸收波長越長。不飽和烴及共軛烯烴2021/6/2761化合物溶劑λmaxεmax顏色1,3－丁二烯己烷21721,000無色1,3,5－己三烯異辛烷26843,000無色1,3,5,7－辛四烯環(huán)己烷304—無色1,3,5,7,9－癸五烯異辛烷334121,000微黃1,3,5,7,9,11－十二烷基六烯異辛烷364138,000微黃某些共軛多烯的吸收光譜特性2021/6/2762特征吸收帶：180nm、204nm處產(chǎn)生E1、E2兩個(gè)強(qiáng)吸收帶，由苯環(huán)結(jié)構(gòu)中三個(gè)π鍵環(huán)狀共軛系統(tǒng)的躍遷產(chǎn)生。精細(xì)結(jié)構(gòu)吸收帶：230～270nm處出現(xiàn)B吸收帶，由π→π*躍遷和苯環(huán)振動(dòng)的重疊引起。

對于稠環(huán)芳烴化合物，苯環(huán)的數(shù)目越多，λmax越大。

苯及其取代衍生物2021/6/27632021/6/2764發(fā)生n→σ*、n→π*和π→π*躍遷，產(chǎn)生三個(gè)吸收帶。n→π*躍遷所需要的能量較低，吸收波長進(jìn)入近紫外光區(qū)或紫外可見光區(qū)。

羰基化合物np

COHH2021/6/2765二、無機(jī)化合物的紫外可見光譜

一些無機(jī)物也產(chǎn)生紫外-可見吸收光譜，其主要能級(jí)躍遷類型包括電荷轉(zhuǎn)移躍遷和配位場躍遷。

2021/6/2766電荷遷移躍遷電子接受體:配合物的金屬中心離子(M);電子給予體:配位體(Ｌ)。

max

較大(104以上)，可用于定量分析。2021/6/2767配場躍遷

過渡元素與配位體配合時(shí)，d或f軌道發(fā)生能級(jí)分裂。低能量軌道上的電子吸收外來能量，躍遷到高能量的d或f軌道，從而產(chǎn)生吸收光譜。2021/6/2768Co(H2O)62+、Ni(H2O)62+、Cu(NH3)42+等呈現(xiàn)出不同顏色，都是由配位場躍遷產(chǎn)生的。2021/6/2769一、主要組成元件二、紫外可見分光光度計(jì)的類型第三節(jié)紫外可見分光光度計(jì)

的結(jié)構(gòu)與原理2021/6/2770一、主要組成元件光源單色器吸收池

檢測器顯示2021/6/27711.光源作用：提供光能,使待測物質(zhì)產(chǎn)生光吸收。要求：提供連續(xù)光譜、穩(wěn)定性良好、使用壽命長、輻射強(qiáng)度隨波長無明顯變化。類型：輻射光源、氣體放電光源2021/6/2772輻射光源種類：鎢燈、鹵鎢燈：波長范圍：360～1000nm應(yīng)用：可見光分光光度計(jì)氣體放電光源種類：氫燈、氘燈波長范圍：160～375nm應(yīng)用：紫外分光光度計(jì)紫外可見分光光度計(jì)需要同時(shí)安裝兩種光源2021/6/27732.單色器作用：從復(fù)合光中分出波長可調(diào)的單色光。組成：入射狹縫、準(zhǔn)光器、色散元件、聚焦元件和出射狹縫

。類型：棱鏡、光柵。2021/6/2774

入射狹縫：光由此進(jìn)入單色器；入射狹縫準(zhǔn)直系統(tǒng)

準(zhǔn)直系統(tǒng)：使入射光成為平行光束；

聚光元件：將所得單色光聚焦至出射狹縫；聚光元件色散元件

色散元件：將復(fù)合光分解成單色光，棱鏡或光柵；λ1λ2

出射狹縫：將單色光比色皿。出射狹縫2021/6/2775玻璃棱鏡適用于可見光區(qū)。石英棱鏡適用于可用于紫外、可見光區(qū)。光柵可用于紫外、可見和近紅外光譜區(qū)。

2021/6/27763.吸收池作用：光與物質(zhì)發(fā)生作用的場所，要求吸收池能讓入射光束通過。

類型：玻璃池—只能用于可見光區(qū)；石英池—可用于可見光區(qū)及紫外光區(qū)。2021/6/27774.檢測器作用：利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號(hào)變成可測的電信號(hào)。

類型：光電池、光電管、光電倍增管。2021/6/2778硒光電池SeFe(Cu)

玻璃

透過光

Ag(Au)薄膜塑料優(yōu)點(diǎn)：使用方便、便于攜帶（耐用、成本低）。缺點(diǎn)：電阻小，電流不易放大；響應(yīng)較慢。只在高強(qiáng)度輻射區(qū)較靈敏；長時(shí)間使用后，有“疲勞”現(xiàn)象。2021/6/2779

透過光陰極抽真空陽極直流放大90伏DC-+陰極表面可涂漬不同光敏物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：電流易放大、響應(yīng)快、應(yīng)用廣。缺點(diǎn)：有微小暗電流。真空光電管

2021/6/2780

光敏陰極

倍增極陽極負(fù)電壓光束優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、響應(yīng)快、適于弱光測定。缺點(diǎn)：暗電流大、需冷卻、不得置于強(qiáng)光下。光電倍增管2021/6/27815.信號(hào)處理及顯示系統(tǒng)作用:放大信號(hào)、顯示或記錄信號(hào)。信號(hào)指示裝置:有直流檢流計(jì)、電位調(diào)零裝置、數(shù)字顯示及自動(dòng)記錄裝置等。微處理機(jī)：對儀器進(jìn)行控制，進(jìn)行圖譜儲(chǔ)存和數(shù)據(jù)處理。2021/6/2782二、紫外可見分光光度計(jì)的類型

單光束分光光度計(jì)雙光束分光光度計(jì)雙波長分光光度計(jì)2021/6/27831.單光束分光光度計(jì)簡單、價(jià)廉；測量給定波長處的吸光度或透光度；一般不能作全波段光譜掃描；要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2021/6/2784儀器復(fù)雜，價(jià)格較高；自動(dòng)記錄、快速全波段掃描；可消除光源不穩(wěn)定、檢測器靈敏度變化；等因素的影響；適合于結(jié)構(gòu)分析。2.雙光束分光光度計(jì)2021/6/27853.雙波長分光光度計(jì)

將不同波長的兩束單色光快速交替通過同一吸收池而后到達(dá)檢測器。產(chǎn)生交流信號(hào)。無需參比池。兩波長同時(shí)掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。2021/6/2786第四節(jié)紫外可見分光光度法的應(yīng)用

一、定性分析二、定量分析2021/6/2787一、定性分析有機(jī)化合物的鑒定結(jié)構(gòu)推斷純度檢驗(yàn)2021/6/27881．未知化合物的定性鑒定依據(jù)：吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目、位置和相應(yīng)的摩爾吸光系數(shù)等。標(biāo)準(zhǔn)物光譜比較法：相同條件下，測定未知物和已知標(biāo)準(zhǔn)物的吸收光譜，進(jìn)行圖譜對比，如果二者的圖譜完全一致，可初步認(rèn)為待測物與標(biāo)準(zhǔn)物為同一種物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)譜圖比較法：如果沒有標(biāo)準(zhǔn)物，可借助紫外可見標(biāo)準(zhǔn)圖譜或有關(guān)電子光譜數(shù)據(jù)資料進(jìn)行比較。2021/6/27892．有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)推斷

化合物某些特征集團(tuán)的判別。若在200～750nm區(qū)域內(nèi)無吸收峰，則可能是直鏈烷烴、環(huán)烷烴、飽和脂肪族化合物或僅含一個(gè)雙鍵的烯烴。若在270～300nm有弱的吸收峰，且隨溶劑極性增大而發(fā)生藍(lán)移，則說明分子內(nèi)含有羰基。若在184nm附近有強(qiáng)吸收帶(E1帶)，在204nm附近有中強(qiáng)吸收帶(E2帶)，在260nm附近有弱吸收帶且有精細(xì)結(jié)構(gòu)(B帶)，說明含有苯環(huán)。2021/6/27903．化合物的純度檢驗(yàn)如果某化合物在紫外區(qū)沒有明顯吸收峰，而其中的雜質(zhì)有較強(qiáng)吸收峰，就能方便的檢出該化合物中是否含有雜質(zhì)。如：苯在256nm處產(chǎn)生B吸收帶，而甲醇或乙醇在該處幾乎沒有吸收帶，因此，要檢驗(yàn)甲醇或乙醇中是否含有苯，可觀察在256nm處是否有吸收帶確定其中是否含有雜質(zhì)苯。2021/6/2791二、定量分析

基本原理：通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度，依據(jù)朗伯-比耳定律，求出溶液中物質(zhì)的濃度。應(yīng)用范圍：單組分、多組分。2021/6/27921.單組分的定量分析

在測定條件下，如果待測組分的吸光系數(shù)已知，可以測定溶液的吸光度，直接根據(jù)朗伯-比爾定律，求出組分的濃度或含量。吸光系數(shù)法（絕對法)2021/6/2793【例1-4】已知維生素B12的在361nm處的質(zhì)量吸光系數(shù)為20.7L·g-1·cm-1。稱取樣品30.0mg，加水溶解后稀釋至1000ml，在該波長處用1.00cm吸收池測定溶液的吸光度為0.618，計(jì)算樣品溶液中維生素B12的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

解：根據(jù)朗伯-比爾定律：2021/6/2794標(biāo)準(zhǔn)對照法預(yù)先配制濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)溶液，要求其濃度Cs與待測試液濃度Cx接近。在相同條件下，平行測定試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度Ax和As。由Cs可計(jì)算試樣溶液中被測物質(zhì)的濃度CxAx=εbCxAs=εbCs2021/6/2795標(biāo)準(zhǔn)曲線法

配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度。繪制吸光度－濃度曲線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線（工作曲線或校正曲線）。在相同條件下測定試樣溶液的吸光度，從校正曲線上找出與之對應(yīng)的未知組分的濃度。2021/6/2796

【例1-4】以鄰二氮菲為顯色劑，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定微量Fe2+。實(shí)驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的濃度及吸光度數(shù)據(jù)，試確定樣品的濃度。

溶液標(biāo)1標(biāo)2標(biāo)3標(biāo)4標(biāo)5

標(biāo)6樣品濃度c×105（mol/L）1.002.003.004.006.008.00cx吸光度A0.1130.2120.3360.4340.6690.8680.7122021/6/2797解：得到回歸方程為：

2021/6/2798二、多組分的定量分析

依據(jù)：吸光度具有加和性。測定試樣中各種純組分的吸收光譜，對比其最大吸收波長，并計(jì)算出對應(yīng)的吸光系數(shù)。解方程，分別求各組分的含量。2021/6/27991.兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾）兩組分在各自λmax下不重疊→分別按單組分定量2021/6/271002.兩組分吸收光譜部分重疊λ1→測A1→y組分不干擾→按單組分定量測Cxλ2→測A2→x組分干擾→不能按單組分定量測Cy2021/6/27101３．吸收光譜相互重疊2021/6/27102第五節(jié)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

一、樣品的制備二、儀器測量條件的選擇三、顯色反應(yīng)條件的選擇四、參比溶液的選擇2021/6/27103一、樣品的制備液體樣品：選擇合適的溶劑溶解。固體樣品：溶劑直接溶解、酸熔融、堿熔融。溶劑：良好的溶解能力;在測定波長范圍內(nèi)沒有明顯的吸收;被測組分在溶劑中有良好的吸收峰形；揮發(fā)性小，不易燃，無毒性，價(jià)格便宜。2021/6/27104二、儀器測量條件的選擇

1．測量波長的選擇：

最大吸收原則：最大吸收波長為測量波長；如果λmax處吸收峰太尖銳,可選用靈敏度低的寬峰波長進(jìn)行測量。

2．吸光度范圍的選擇

A的測量范圍為0.2～0.8(T％為65～15％)

3．儀器狹縫寬度的選擇狹縫過寬，入射光的單色性降低，標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離比耳定律，準(zhǔn)確度降低；狹縫寬度過窄時(shí)，光強(qiáng)變?nèi)酰`敏度降低。2021/6/27105三、顯色反應(yīng)條件的選擇顯色反應(yīng)：將待測組分轉(zhuǎn)化為有色物質(zhì)的反應(yīng)。顯色劑：與待測組分形成有色物質(zhì)的試劑稱為。2021/6/271061．顯色劑及其用量的選擇顯色劑與待測離子反應(yīng)生成組成恒定、穩(wěn)定性強(qiáng)的產(chǎn)物；顯色條件易于控制；產(chǎn)物對紫外可見光有較強(qiáng)的吸收能力；顯色劑與產(chǎn)物的顏色差異要大；

2021/6/27107顯色劑用量：固定金屬離子濃度，作吸光度隨顯色劑濃度的變化曲線，選取吸光度恒定時(shí)的顯色劑用量。2021/6/271082.反應(yīng)的pH

固定溶液中待測組分和顯色劑的濃度，改變?nèi)芤簆H，分別測定在不同pH溶液的吸光度A，繪制A～pH曲線，從中找出最適宜的pH范圍。2021/6/27109

Fe3+-水楊酸配合物與pH關(guān)系

pH范圍配合物組成顏色＜4Fe(C7H4O3)+（1:1）紫紅色4～7Fe(C7H4O3)2－（1:2）棕橙色8～10Fe(C7H4O3)33－（1:3）黃色2021/6/271103.顯色的時(shí)間反應(yīng)速度較慢的反應(yīng)體系，需要有足夠的反應(yīng)時(shí)間；酸度、顯色劑的濃度都會(huì)影響顯色時(shí)間。

2021/6/271114.反應(yīng)的溫度

吸光度的測量