細(xì)胞融合技術(shù)及相關(guān)進(jìn)展

細(xì)胞融合技術(shù)及相關(guān)進(jìn)展摘要：細(xì)胞工程是四大生物工程之一，在生物、醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域取得了開(kāi)創(chuàng)性的研究成果。細(xì)胞融合方法得到不斷更新，融合率也得到逐步提高。該技術(shù)在細(xì)胞遺傳學(xué)、單克隆抗體及種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用等方面的研究具有重要意義。因此本文對(duì)細(xì)胞融合的定義機(jī)理、應(yīng)用及融合技術(shù)方面的相關(guān)研究成果進(jìn)行總結(jié)和闡述。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞融合；生物法；化學(xué)法；物理法

細(xì)胞融合技術(shù)是近30多年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新興細(xì)胞工程技術(shù)，已在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥等多領(lǐng)域取得研究成果，且應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大[1]。細(xì)胞融合不僅為細(xì)胞的起源、肌肉骨骼胎盤(pán)的發(fā)育、干細(xì)胞介導(dǎo)的組織再生等理論領(lǐng)域研究提供了有力手段，而且被廣泛應(yīng)用于育種學(xué)、發(fā)生生物學(xué)及免疫醫(yī)學(xué)，特別是在動(dòng)植物新品種的培育、單克隆抗體的制備以及抗癌疫苗的研發(fā)等方面具有重要意義。

1細(xì)胞融合的定義及機(jī)理

細(xì)胞融合也稱(chēng)細(xì)胞雜交，是在自然條件下或用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的同源或異源細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合而形成雜種細(xì)胞的過(guò)程。

細(xì)胞融合與病毒和細(xì)胞之間的融合有許多相似之處，即帶包被的病毒或細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)膜病毒蛋白介導(dǎo)與宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)行融合，過(guò)程中伴隨蛋白構(gòu)象的變化。細(xì)胞融合主要經(jīng)過(guò)以下幾個(gè)主要步驟：原生質(zhì)體或細(xì)胞相互靠近；質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋；胞質(zhì)滲透；細(xì)胞核融合。其中細(xì)胞橋的形成是細(xì)胞融合的關(guān)鍵一步，而只有細(xì)胞核發(fā)生了融合，多核細(xì)胞才能存活下去。

2細(xì)胞融合的方法

2.1生物法

病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用而與宿主細(xì)胞膜直接融合。當(dāng)其同時(shí)進(jìn)入兩個(gè)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，打破兩個(gè)細(xì)胞膜的隔閡，引起細(xì)胞質(zhì)的交流，進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生融合。

單純皰疹病毒（HSV）：HSV介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞融合需要四種關(guān)鍵包膜蛋白gD，gB和異二聚體gH/gL，其介導(dǎo)細(xì)胞融合的過(guò)程如下：gD與細(xì)胞受體結(jié)合，導(dǎo)致其胞外域的C端部分發(fā)生構(gòu)象變化，暴露出核心部位[2]；激活的gD與gH/gL相互作用并將其轉(zhuǎn)化為正調(diào)控因子；正調(diào)控因子激活gB成為活性的融合因子[3]。最終將導(dǎo)致病毒和宿主細(xì)胞膜之間的融合，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞融合。

流感病毒：流感病毒顆粒與宿主細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合后，通過(guò)內(nèi)吞作用被內(nèi)化；內(nèi)含體膜中的蛋白質(zhì)泵會(huì)降低含病毒體的隔室內(nèi)的pH，而產(chǎn)生兩種效果：由于質(zhì)子可以通過(guò)M2離子通道進(jìn)入病毒粒子內(nèi)部，導(dǎo)致粒子內(nèi)部pH降低，M1層分離，使膜更具延展性并有助于融合[4]；低pH誘導(dǎo)內(nèi)含體中病毒糖蛋白血凝素的構(gòu)象變化，導(dǎo)致病毒和細(xì)胞膜融合[5]，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞融合。

信號(hào)通路介導(dǎo)法：研究發(fā)現(xiàn)MSCs和mESCs可以在共培養(yǎng)中自發(fā)形成融合衍生的雜合體，盡管效率較低。且Rho-Rock-actin/肌球蛋白途徑不僅對(duì)MSC分化和ESC自我更新至關(guān)重要[6]，對(duì)ESC中的細(xì)胞融合也是重要的。相反，其抑制作用使MSC皮層張力減少，形成流動(dòng)性更好的質(zhì)膜，其促進(jìn)MSC變形和ESC侵入[7]。研究已經(jīng)證明不同類(lèi)型的細(xì)胞，包括MSC，神經(jīng)元細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞可以通過(guò)隧道納米管[8，9]交換囊泡和線(xiàn)粒體等胞質(zhì)成分。

2.2化學(xué)法

化學(xué)法是指采用化學(xué)誘導(dǎo)劑改變細(xì)胞膜脂質(zhì)分子排列誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法。

Janus粒子誘導(dǎo)融合：研究表明，包含氫化、氟化和混合氫化氟化JD的Janus樹(shù)枝狀聚合物的三組分體系通過(guò)膜水合以特定比例共組合成前所未有的超分子粒子，表示為Janus樹(shù)枝狀大分子。它們由啞鈴形結(jié)構(gòu)組成，由洋蔥狀氫化囊泡和洋蔥狀氟化囊泡系在一起。相同三組分體系的不同比例能產(chǎn)生各種結(jié)構(gòu)，包括均勻的洋蔥狀囊泡、核-殼結(jié)構(gòu)和完全自我分選的氫化和氟化囊泡[10]；其自分選途徑可用于穩(wěn)定氫化和氟化雙層之間的界面。裂變樣途徑表明在生物系統(tǒng)中融合和裂變過(guò)程可能不需要蛋白質(zhì)的參與，而是可以由膜組成比率的改變引起[11]。

缺氧誘導(dǎo)融合：研究發(fā)現(xiàn)缺氧促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞與人永生化口腔上皮細(xì)胞之間的自發(fā)性細(xì)胞融合。因?yàn)榈脱蹩蓪?dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[12]，其會(huì)改變上皮細(xì)胞表面的一些蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的變化使上述兩種細(xì)胞的融合率增加，而DAPT（EMT阻斷劑）顯著降低融合率[13]。

聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)融合：PEG促細(xì)胞融合的機(jī)制如下：PEG分子具有弱負(fù)極性，可以與具有正極性基團(tuán)的水分子、蛋白質(zhì)等形成氫鍵，在相鄰的原生質(zhì)體間起到分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸。當(dāng)其被洗脫時(shí)，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時(shí)，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團(tuán)可能與另一個(gè)原生質(zhì)體中帶負(fù)電的基團(tuán)相連，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。PEG還可以增加類(lèi)脂膜的流動(dòng)性，使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能，從而促進(jìn)細(xì)胞融合。此外，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)Mg2+濃度至合適區(qū)間可以達(dá)到較高的細(xì)胞融合率，從而為PEG化學(xué)融合提供了一種優(yōu)化方案[14]。

離子誘導(dǎo)融合法：Kuster發(fā)現(xiàn)機(jī)械分離的發(fā)生了質(zhì)壁分離的洋蔥表皮細(xì)胞原生質(zhì)體在NaNO3溶液中可以恢復(fù)并伴隨著細(xì)胞融合。NaNO3的鈉離子可以中和原生質(zhì)體表明負(fù)電荷，引起原生質(zhì)體聚集，誘導(dǎo)細(xì)胞融合。Keller首先發(fā)現(xiàn)高Ca2+和高pH值可以誘發(fā)細(xì)胞融合。鈣離子中和原生質(zhì)體膜或細(xì)胞膜表面電荷，使彼此緊密接觸；高pH能改變質(zhì)膜的表面電荷，利于細(xì)胞融合。

2.3物理法

電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)：指利用電場(chǎng)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，再施加瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿促進(jìn)細(xì)胞融合的技術(shù)，是最常用的物理誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法。研究發(fā)現(xiàn)，電脈沖誘導(dǎo)的細(xì)胞融合的程度受電壓力和滲透力的影響；并且滲透現(xiàn)象在胞吐中是重要的，因此滲透力可以為生物系統(tǒng)中的許多膜融合反應(yīng)提供驅(qū)動(dòng)力。

激光融合技術(shù)：指利用光鑷捕捉并拖動(dòng)一個(gè)細(xì)胞使之靠近另一個(gè)細(xì)胞并緊密接觸，然后對(duì)接觸處進(jìn)行脈沖激光束處理，使質(zhì)膜發(fā)生光擊穿，產(chǎn)生微米級(jí)的微孔。這樣由于質(zhì)膜上微孔的可逆性，細(xì)胞開(kāi)始變形融合，最終成為一個(gè)細(xì)胞。QuetF.Ahkong等人[15]采用激光誘導(dǎo)單細(xì)胞融合技術(shù)，成功制備融合肝細(xì)胞癌細(xì)胞和干細(xì)胞基因表達(dá)信息的融合細(xì)胞系。

空間細(xì)胞融合技術(shù)：由于地球引力的存在，有液泡的原生質(zhì)體與無(wú)液泡的原生質(zhì)體的密度差很大，異源細(xì)胞間的融合得率十分有限。在利用動(dòng)物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體過(guò)程中，在地面上由于無(wú)法排除地球引力的影響，要提高細(xì)胞融合得率相當(dāng)困難。上世紀(jì)80年代以來(lái)，人們?cè)诳臻g材料科學(xué)的啟發(fā)下，試圖利用空間微重力條件改進(jìn)細(xì)胞融合技術(shù)。大量的飛行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在微重力條件下酵母細(xì)胞的融合得率有很大的增加，原因主要是降低了重力沉降影響，而雜種細(xì)胞的活力增加可能是由細(xì)胞排列時(shí)間縮短引起的。

離子束細(xì)胞融合技術(shù)：離子束細(xì)胞融合技術(shù)原理如下：采用微束對(duì)細(xì)胞進(jìn)行超微加工，有目的地切割染色體，通過(guò)消除部分染色體或染色體的某些片段達(dá)到細(xì)胞非對(duì)稱(chēng)融合[16]；在離子束與細(xì)胞相互作用中，粒子的植入、動(dòng)量的傳遞和電荷交換可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和跨膜電場(chǎng)的改變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合[17]。

非對(duì)稱(chēng)細(xì)胞融合技術(shù)：指利用某種外界因素輻照某一細(xì)胞原生質(zhì)體，選擇性地破壞其細(xì)胞核，并用碘乙酰胺堿性蕊香紅6G處理在細(xì)胞核中含有優(yōu)良基因的第二種原生質(zhì)體，選擇性地使其細(xì)胞質(zhì)失活。然后融合來(lái)自這兩個(gè)原生質(zhì)體品系的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)所需胞質(zhì)和細(xì)胞核基因的優(yōu)化組合；或使前者被打碎的細(xì)胞核染色體片段中的個(gè)別基因滲入到后者原生質(zhì)體的染色體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)有限基因的轉(zhuǎn)移，從而在保留親本全部?jī)?yōu)良性狀的同時(shí)改良其某個(gè)不良性狀。

2.4物理-化學(xué)結(jié)合法

植物血凝素-ECM830細(xì)胞融合法：植物血凝素是一種有絲分裂原，可以起到細(xì)胞凝聚的作用，使得兩細(xì)胞膜緊密接觸。MIRui-fang等人[18]證實(shí)在植物血凝素作用的基礎(chǔ)上進(jìn)行ECM830電擊融合，可以大大提高細(xì)胞融合效率。

3細(xì)胞融合的應(yīng)用

3.1動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用

用于研究細(xì)胞的核質(zhì)關(guān)系、揭示疾病發(fā)生的機(jī)制、基因定位、衰老機(jī)制、動(dòng)物育種、生產(chǎn)單克隆抗體、細(xì)胞療法等。如以聚乙二醇作為介導(dǎo)，將小白鼠骨髓的瘤細(xì)胞和進(jìn)行綿羊紅細(xì)胞免疫處理的小白鼠B淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，從而形成單克隆抗體技術(shù)[19]。

3.2植物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用

改善作物品質(zhì)、培育抗逆植株、種質(zhì)保存和有用物質(zhì)生產(chǎn)、無(wú)性系的快速繁殖和植物疾病防治等。如用細(xì)胞融合技術(shù)將球形芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌進(jìn)行融合，培養(yǎng)出具有滅蚊和滅螟能力的新菌株[19]。

3.3微生物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用

用于生物藥品的生產(chǎn)，包括抗生素、生物活性物質(zhì)、疫苗等；如細(xì)胞融合棘孢小單孢菌和灰色鏈霉菌素，相比于親本菌，融合子產(chǎn)慶大霉素的產(chǎn)量明顯得到提高[19]。還為發(fā)酵工業(yè)提供優(yōu)良菌種，如釀酒酵母和糖化酵母的種間雜交，分離子后代中個(gè)別菌株具有糖化和發(fā)酵的雙重能力。

結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞融合技術(shù)在生物、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，其發(fā)展前景非常廣闊。因此，來(lái)自物理、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的各國(guó)科學(xué)家相繼在該領(lǐng)域傾注了大量人力物力進(jìn)行專(zhuān)項(xiàng)研究。毫無(wú)疑問(wèn)，它將成為21世紀(jì)的新興產(chǎn)業(yè)，定能為人類(lèi)帶來(lái)福音。

參考文獻(xiàn)：

[1]李樂(lè)，張城碩，張佳林.細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].遼寧醫(yī)學(xué)雜志，2013，27（04）：195-8.

[2]LazearE，WhitbeckJC，PoncedeleonM，etal.Antibody-InducedConformationalChangesinHerpesSimplexVirusGlycoproteingDRevealNewTargetsforVirusNeutralization[J].JournalofVirology，2012，86（3）：1563-76.

[3]AtanasiuD，SawWT，CohenGH，etal.CascadeofEventsGoverningCell-CellFusionInducedbyHerpesSimplexVirusGlycoproteinsgD，gH/gL，andgB[J].JournalofVirology，2010，84（23）：12292-9.

[4]FontanaJ，StevenAC.InfluenzaVirusMatrixProteinM1UndergoesaConformationalChangePriortoDissociatingfromtheMembrane[J].JournalofVirology，2013，87（10）：5621-8.

[5]HamiltonBS，WhittakerGR，SusanD.InfluenzaVirus-MediatedMembraneFusion：DeterminantsofHemagglutininFusogenicActivityandExperimentalApproachesforAssessingVirusFusion[J].Viruses，2012，4（7）：1144-68.

[6]MurrayP，etal.Theself-renewalofmouseembryonicstemcellsisregulatedbycell-substratumadhesionandcellspreading[J].IntJBiochemCellBiol，2013，45：2698–705.

[7]SottileF，AulicinoF，ThekaI，etal.Mesenchymalstemcellsgeneratedistinctfunctionalhybridsinvitroviacellfusionorentosis[J].ScientificReports，2016，6：36863.

[8]SinclairKA，YerkovichST，HopkinsPM，etal.Characterizationofintercellularcommunicationand

mitochondrialdonationbymesenchymalstromalcellsderivedfromthehumanlung[J].StemCellResTher，2016，7：91.

[9]AbounitS，etal.Tunnelingnanotubesspreadfibrillaralpha-synucleinbyintercellulartraffickingoflysosomes[J].EMBOJ，2016，35：2120–38.

[10]XiaoQ，etal.Self-sortingandcoassemblyoffluorinated，hydrogenated，andhybridJanusdendrimersintodendrimersomes[J].JAmChemSoc，2016，138：12655–63.

[11]XiaoQ，ShermanSE，WilnerSE，etal.Janusdendrimersomescoassembledfromfluorinated，hydrogenated，andhybridJanusdendrimersasmodelsforcellfusionandfission[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2017，114（34）：E7045.

[12]ChenS，ChenJZ，ZhangJQ，etal.HypoxiainducesTWIST-activatedepithelial–mesenchymaltransitionandproliferationofpancreaticcancercellsinvitroandinnudemice[J].CancerLetters，2016，383：73–84.

[13]HuangCM，YanTL，XuZ，etal.HypoxiaEnhancesFusionofOralSquamousCarcinomaCellsandEpithelialCellsPartlyviatheEpi