《動物分枝桿菌多重實時熒光 PCR 檢測方法》

ICS11.220

B41

團體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVMAX—2020

動物分枝桿菌多重實時熒光PCR檢測方法

Multiplexreal-timePCRdetectionmethodofMycobacteriuminanimal

征求意見稿

2019-XX-XX發(fā)布2019-XX-XX實施

中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布

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動物分枝桿菌多重實時熒光PCR檢測方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物分枝桿菌多重實時熒光PCR檢測試劑、儀器設(shè)備、實驗操作步驟。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于動物組織、分泌物、血液、糞便和培養(yǎng)物中分枝桿菌的核酸檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB19489-2008實驗室生物安全通用要求

NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范

GB/T18645-2020動物結(jié)核病診斷技術(shù)

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件

EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）

PBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphatebuffersaline）

ITS：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（InternalTranscribedSpacer）

UNG：尿嘧啶DNA糖基化酶（UracilN-Glycosylase）

DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）

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Tm值：在熱變性過程中，隨著溫度的逐漸升高，探針逐漸從靶序列上脫落，其雙鏈解鏈到一半時所

對應(yīng)的溫度稱為他們的熔解溫度（MeltingTemperature）

5試劑和耗材

5.1試劑

5.1.1蒸餾水或滅菌雙蒸水：常溫保存。

5.1.275%乙醇：可購買，或者用無水乙醇和滅菌后雙蒸水配制。

5.1.3檸檬酸鈉緩沖液：配制方法按附錄A中A.1。

5.1.40.5mol/LEDTA：配制方法按附錄A中A.2

5.1.50.01mol/LpH7.6PBS：配制方法按附錄A中A.3。

5.1.64%氫氧化鈉消化液：配制方法按附錄A中A.4。

5.1.7血液抗凝劑：商品化試劑。

5.1.8DNA提取液：配制方法按附錄A中A.5。

5.1.9多重實時熒光PCR檢測（熔解曲線法）試劑：廈門致善生物科技股份有限公司購買。

5.2耗材

5.2.1無菌注射器。

5.2.2真空采血管。

5.2.3無菌離心管。

5.2.4熒光定量PCR管（0.2mL）。

5.2.5微量移液器吸頭（與微量移液器相應(yīng)規(guī)格適配）。

6儀器與設(shè)備

6.1超凈工作臺。

6.2熒光定量PCR擴增儀（如SLAN-96S：上海宏石醫(yī)療科技有限公司）。

6.3高速臺式冷凍離心機，可控溫至4℃，離心速度可達15000g以上。

6.4微量移液器：量程為0.5μL~10μL、2μL~20μL、20μL~200μL和200μL~1000μL。

6.5渦旋震蕩儀。

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6.6分析天平。

6.7冰箱：2℃~8℃、-20℃和-80℃以下。

6.8恒溫水浴鍋：0℃~100℃。

6.9組織研磨器或研缽。

6.10高壓滅菌鍋。

6.11pH計。

6.12微波爐。

6.13磁力攪拌器。

7樣品的采集與處理

7.1樣品采集

樣品采集按照GB/T18645-2020進行。

7.1.1采樣工具

無菌注射器、真空采血管、無菌的容器、無菌橡膠管、剪刀、鑷子、無菌離心管、研缽。

采樣工具用高壓（121℃±2℃/0.1MPa）15min滅菌并烘干，或160℃干烤1h滅菌；或使用一

次性無菌用等效工具。

7.1.2血液樣品

用無菌注射器或真空采血管，自動靜脈采血，無菌分離血清。

用無菌注射器或真空采血管，自動靜脈采血，將血液直接滴入抗凝劑中，并立即連續(xù)搖動，充分混

合?？鼓齽┎捎脵幟仕徕c緩沖液，或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝劑。條件允許時，應(yīng)優(yōu)先

采用全血，以更有利于富集菌體。

7.1.3乳液樣品

無菌采集乳樣于無菌的容器中。一般以擠出的后段乳樣含菌量較多，清晨擠出的乳樣含菌量最高。

7.1.4痰液樣品

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清晨，用橡膠管自口腔伸入至氣管內(nèi)，外接注射器吸取痰液；或直接采集咳出的痰塊。

7.1.5組織樣品

采集動物下頜、咽后、支氣管、肺（特別是肺門淋巴結(jié)）、縱膈和腸系膜淋巴結(jié)，以及病變組織器

官（如：肝、脾等）。

7.1.6糞便樣品

采集混有黏液、血液、黏膜的糞便，或用刮匙從動物直腸深部（30cm）取少量黏液糞便，盛于無

菌的容器中。

7.2樣品處理

7.2.1血液樣品處理

取1mL～2mL全血樣品，15000g離心10min，棄上清液；加等量體積滅菌雙蒸水充分振蕩，15000

g離心10min；棄上清液，若紅細胞裂解不完全，應(yīng)采用滅菌雙蒸水重復(fù)洗滌；收集沉淀物，進行核酸

提取，或置于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

7.2.2乳液樣品處理

取10mL乳樣，加100mLTritonX-100，振蕩混勻，2500g離心20min；棄上清液，取沉淀，加1mL

0.01mol/LpH7.6PBS重懸沉淀，充分振蕩混勻；將沉淀懸浮液移入微量離心管，15000g離心10min；

棄上清液，收集沉淀物，繼續(xù)進行核酸提取，或置于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

7.2.3痰液樣品處理

在痰液樣品加入2倍～4倍體積4%氫氧化鈉消化液，振蕩混勻，室溫放置30min，間或振蕩混勻，

使其充分液化（無明顯固狀物并且吸出時無拖絲現(xiàn)象即為液化完全；若液化不完全，可適當(dāng)再加入少量

4%氫氧化鈉消化液直至液化完全）；15000g離心10min；棄上清液，加1mL0.01mol/LpH7.6PBS，

充分振蕩混勻，15000g離心10min，棄上清液，重復(fù)本步驟一次；收集沉淀物，進行核酸提取，或置

于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

7.2.4組織樣品處理

分別從三個不同的位置取適量的組織樣品（剔除脂肪、被膜），剪碎，按1:5的比例加入檸檬酸鈉-

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磷酸緩沖液（例：1g組織樣品加入5mL緩沖液），充分研磨；加入等量4%氫氧化鈉消化液，繼續(xù)研磨

5min～10min，使組織液化，轉(zhuǎn)移至微量離心管，充分振蕩，75℃溫浴0.5h～1h；取上清液（避免

吸取粗渣），15000g離心10min；棄上清液，加等量0.01mol/LpH7.6PBS，振蕩混勻，使沉淀充分

懸浮，15000g離心10min，棄上清液，重復(fù)本步驟1次；收集沉淀物，進行核酸提取，或置于-20℃貯

存?zhèn)溆谩?/p>

7.2.5糞便樣品處理

取1～2g糞便樣品，按1:5的比例加入4%硫酸溶液（例：1g糞便加5mL液體），充分振蕩混勻，

室溫靜置0.5～1h；取上層約3mL液體（避免吸取粗渣），5000g離心1min，取上清液，15000g離心

10min；棄上清液，加等量0.01mol/LpH7.6PBS，充分振蕩混勻，15000g離心10min，棄上清液，

重復(fù)本步驟1次；收集沉淀物，繼續(xù)進行核酸提取，或置于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

8操作程序

8.1細菌DNA的提取

在樣品制備區(qū)進行。

8.1.1血液樣品、痰液樣品、組織樣品、乳液樣品中細菌DNA的提取

在處理后的沉淀物中加入50μL～100μLDNA提取液，充分振蕩混勻，56℃溫浴30min，98℃～

100℃加熱10min，瞬時離心使液體聚集管底，加等體積三氯甲烷，振蕩混勻，12000g離心5min，取

上清液，直接用于PCR或貯存于-80℃?zhèn)溆?。也可采用其他等效的商品化細菌基因組DNA提取試劑盒提取。

8.1.2糞便樣品中細菌DNA的提取

在處理后的沉淀物中加入50μL～100μLDNA提取液，充分振蕩混勻，56℃溫浴30min，98℃～

100℃加熱10min，瞬時離心使液體聚集在管底，加等體積三氯甲烷，振蕩混勻，12000g離心5min，

取上清液，加入等體積異丙醇（-20℃預(yù)冷），顛倒混勻，放置5min～10min，棄上清液，室溫干燥5

min；加入50μL、無DNA酶、無RNA酶水，混勻，溶解核酸，直接用于PCR或貯存于-80℃?zhèn)溆谩Ｒ部刹?/p>

用其他等效的商品化細菌基因組DNA提取試劑盒提取。

8.1.3若采用其他商業(yè)化的核酸提取試劑盒或自動化核酸提取儀提取各類樣品的核酸時，請按照說明

書進行操作。

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8.2擴增試劑的準(zhǔn)備與配制

8.2.1在試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)進行。

8.2.2首先將除酶混合液外的所有試劑從冰箱取出并平衡至室溫。

8.2.3PCR反應(yīng)液配液標(biāo)準(zhǔn)為：分別取（n+1）×19.6μLPCRMix和（n+1）×0.4μLDNA聚合酶

混合液加入到1.5mL離心管中，將離心管輕震混勻，3000g離心數(shù)秒。配好的PCR反應(yīng)液必須貯存在

8℃以下，并在4小時內(nèi)使用。

注：n=實際檢測樣本所需測試數(shù)+陽性對照測試數(shù)+陰性對照測試數(shù)。

8.2.4分裝PCR反應(yīng)液：PCR反應(yīng)液以每管20μL分裝于PCR薄壁反應(yīng)管。

8.2.5將配制好的PCR反應(yīng)管裝入自封袋轉(zhuǎn)移至至樣本制備區(qū)。貯存在8℃以下直至樣品提取處理完

畢。

8.3加樣

8.3.1在樣本制備區(qū)進行。

8.3.2用微量加液器向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入相應(yīng)的提取樣品或陰性/陽性對照5μL。立即蓋嚴(yán)

管蓋。

注：每次實驗應(yīng)設(shè)置陽性和陰性對照進行質(zhì)量控制。

8.3.3將已加入模板的PCR薄壁反應(yīng)管瞬時離心數(shù)秒，除去氣泡，并轉(zhuǎn)移至PCR擴增區(qū)。

8.4多重實時熒光PCR擴增及熔解曲線分析

8.4.1在擴增區(qū)進行。

8.4.2將8.3.3中加樣后的反應(yīng)管放入SLAN-96S熒光PCR儀中，擴增與熔解曲線分析步驟連續(xù)完成。

8.4.3.1反應(yīng)程序設(shè)定如下：

體系本試劑盒反應(yīng)體系設(shè)為25μL

階段條件循環(huán)數(shù)

PCR反應(yīng)

UNG酶處理50℃2分鐘1

程序

預(yù)變性95℃10分鐘1

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95℃15秒

PCR循環(huán)程序57℃20秒55

78℃20秒

保溫40℃30分鐘1

95℃2分鐘

熔解分析40℃2分鐘

1

程序40℃～90℃，采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道

熒光信號，連續(xù)采光，升溫速率0.04℃/S

8.4.3.2程序運行完畢，將PCR薄壁反應(yīng)管（閉管）取出放入密封袋，將封口封嚴(yán)，按污染源處理。

9結(jié)果判定

檢測結(jié)果將由軟件自動輸出，也可進行人工判讀；可參照附錄B的結(jié)果判讀原則進行判斷。

9.1結(jié)果分析條件設(shè)定

閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照樣品擴增曲線的最高點為準(zhǔn)，具體需根據(jù)儀器噪聲情

況進行調(diào)整。

9.2試驗成立的條件

陰性對照：ROX通道只出現(xiàn)79.2±1.7℃（內(nèi)控熔點）的熔解峰，其它通道應(yīng)無熔解峰。

陽性對照：FAM通道只出現(xiàn)61.3±1.5℃（結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異熔點）的熔解峰；ROX通道只出現(xiàn)72.5

±1.6℃（分枝桿菌屬特異熔點）和79.2±1.7℃（內(nèi)控熔點）的兩個熔解峰。其它通道應(yīng)無熔解峰。

9.2.1和9.2.2要求須在同一次試驗中同時滿足，否則，本次試驗無效，需重新進行。

結(jié)果判定

陰性

樣品在ROX通道只出現(xiàn)79.2±1.7℃（內(nèi)控熔點）的熔解峰，其他通道均無熔解峰，則表示樣品中無

分枝桿菌核酸。

陽性

9.2.1.1單一感染陽性判定

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樣品在ROX通道出現(xiàn)72.5±1.6℃（分枝桿菌屬特異熔點）和79.2±1.7℃（內(nèi)控熔點）的兩個熔解

峰，此時表示樣品中存在分枝桿菌核酸，具體菌種可根據(jù)各分枝桿菌特異熔解峰的熔點進行判讀，參考

值如下：

恥垢分枝桿菌：FAM通道81.5±1.5℃；

瘰疬分枝桿菌：FAM通道67.5±1.7℃；

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群：FAM通道61.3±1.5℃；

龜分枝桿菌：FAM通道54±1.5℃；

副結(jié)核分枝桿菌：HEX通道70.8±1.3℃，Cy5通道65.5±2.2℃；

堪薩斯分枝桿菌：HEX通道63.5±2.2℃；

偶然分枝桿菌：ROX通道65.3±1.5℃；

潰瘍分枝桿菌或海分枝桿菌：ROX通道58.2±1.5℃；

胞內(nèi)分枝桿菌：Cy5通道65.5±2.2℃；

鳥分枝桿菌：Cy5通道59.5±1.6℃；。

若沒有出現(xiàn)以上特異的熔點，則表明樣品中含有本方法鑒定范圍以外的其他分枝桿菌菌種。

9.2.2混合感染陽性判定

當(dāng)四個通道內(nèi)，除了ROX通道的內(nèi)控峰和分枝桿菌屬的熔解峰以外，出現(xiàn)兩個或者多個特異性熔解

峰，根據(jù)其熔點判讀相應(yīng)的菌種。包含2種或2種以上分枝桿菌的樣品為混合感染樣品。

9.2.3樣品無效

若樣品在ROX通道沒有出現(xiàn)79.2±1.7℃（內(nèi)控熔點）的熔解峰，則表示樣品檢測結(jié)果無效。出現(xiàn)這

種情況的原因可能是樣品經(jīng)提取后核酸中含有抑制PCR反應(yīng)的雜質(zhì)或者實驗人員操作出現(xiàn)錯誤，經(jīng)過原

因排查后可重新提取樣本的核酸后復(fù)檢。

9.2.4可能影響檢測結(jié)果的因素

實驗室環(huán)境污染、試劑污染、樣品交叉污染會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；試劑運輸、保存不當(dāng)或試劑配制不

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準(zhǔn)確會引起試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果。

10注意事項

10.1采樣及樣品處理過程，應(yīng)防止不同樣品之間通過器具、手套等的交叉污染。采樣及樣品處理工具

應(yīng)經(jīng)過高壓滅菌或高溫烘烤處理，一套工具僅限一個樣品使用。存放樣品的容器應(yīng)清洗、高壓滅菌或高

溫烘烤處理，或使用一次性滅菌容器。

10.2實驗過程，應(yīng)穿工作服和戴一次性手套，勤換手套，工作服應(yīng)經(jīng)常清洗。

10.3使用無菌耗材。吸頭、離心管、PCR管等應(yīng)經(jīng)過高壓滅菌處理，一次性使用，不得回收清洗后重

復(fù)使用。

10.4樣品處理與PCR加樣應(yīng)在不同的區(qū)域進行,不同區(qū)域配備獨立的加樣工具和用具。該區(qū)域可以是

獨立的空間間隔、有紫外消毒設(shè)施的獨立的設(shè)備如核酸提取工作站、PCR加樣工作站、可密閉進行紫外

消毒的超凈工作臺、生物安全柜等。若在敞開的空間進行核酸提取或PCR加樣，該空間應(yīng)安裝紫外燈或

配備具有等同降解核酸功能的設(shè)備如移動紫外燈、帶紫外消毒功能的空氣消毒凈化器等。上述區(qū)域在每

次使用后應(yīng)及時清潔處理，并在使用前后照射紫外30min以上。每個區(qū)域應(yīng)有專門的廢棄物容器，該

容器應(yīng)能耐受煮沸、10%次氯酸鈉溶液消毒處理。每次實驗結(jié)束，應(yīng)在紫外消毒前，及時清理廢棄物及

消毒容器，并將該廢棄物容器放回工作區(qū)進行紫外消毒。

10.5PCR反應(yīng)液等試劑應(yīng)按檢測需求分裝貯存，避免同一管試劑多次開啟使用。

10.6裝有核酸模板、樣品或試劑的離心管在打開之前，應(yīng)短暫離心，避免離心管崩開，避免產(chǎn)生氣溶

膠。

10.7上機運行前，應(yīng)檢查蓋緊各PCR管，以防熒光物質(zhì)或模板泄漏而污染機器。

10.8應(yīng)遵循基因檢測實驗室其他技術(shù)要求。

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附錄A

（規(guī)范性附錄）

DNA提取試劑的配制

A.1檸檬酸鈉緩沖液

檸檬酸5.3g

檸檬酸鈉15.0g

葡萄糖16.2g

稱取上述試劑，溶解于蒸餾水，定容至1L，混勻。121℃±2℃高壓滅菌15min，貯存于4℃。

A.20.5mol/LEDTA(pH8.0)

稱取186.1gEDTA，加入到800mL蒸餾水中，磁力攪拌器上劇烈攪拌，用氫氧化鈉調(diào)pH值至8.0

定容至1L，分裝后121℃±2℃高壓滅菌15min，室溫貯存。

A.30.01mol/LpH7.6PBS

先配制A液、B液：

A液（0.2mol/LNaH2PO4溶液）：稱取一水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H2O）27.6g，或二水合磷酸

二氫鈉（NaH2PO4?2H2O）31.2g，溶于蒸餾水中，定容至1L。

B液（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：稱取十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）71.6g，或二水合磷

酸氫二鈉（Na2HPO4?2H2O）35.6g，溶于蒸餾水中，定容至1L。

稱取17g氯化鈉，用適量蒸餾水溶解，量取13mLA液加87mLB液，用蒸餾水定容至1L。

A.4氫氧化鈉消化液

取35g～40gNaOH，2g鉀明礬，20mg溴麝香草酚藍（預(yù)先用60%酒精配制成0.4%濃度，應(yīng)

用時按比例加入），加入1L蒸餾水混勻，即為氫氧化鈉消化液。

A.5DNA提取液

含100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，0.01%TritonX-100，200μg/μL蛋白酶K?？刹捎玫刃?/p>

品化試劑。

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附錄B

（資料性）

多重實時熒光PCR檢測（探針熔解曲線法）

B.1試劑

B.1.1DNA提取相關(guān)試劑的配制

見附錄A。

B.1.2PCRMix溶液

檢測十項分枝桿菌所需的引物探針和buffer的預(yù)混液。

B.1.3DNA聚合酶混合液

檢測十項分枝桿菌所需的DNA聚合酶混合液。

B.1.4擴增區(qū)域

分枝桿菌屬檢測擴增區(qū)域

檢測區(qū)域

序列信息(5′→3′)

（以結(jié)核分枝桿菌的檢測區(qū)域為例）

TCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGC

AGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT

CACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCAGTGGCCTAACCCTCGGGAGGG

AGCTGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGT

>CP072765.1:1473145-1473795ACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAGCACCACGAAAACGCC

MycobacteriumtuberculosisstrainCCAACTGGTGGGGCGTAGGCCGTGAGGGGTTCTTGTCTGTAGTGGGCGAGAGC

CGGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCACCAACACACTGTTGGGTCCTGAGGCAA

H37Rv_CGchromosome,completeCACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGTG

genomeTTTGAGAACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCAATGGATACGCTGCCGGCTAGCG

GTGGCGTGTTCTTTGTGCAATATTCTTTGGTTTTTGTTGTGTTTGTAAGTGTC

TAAGGGCGCATGGTGGATGCCTTGGCATCGAGAGCCGATGAAGGACGTGGGAG

GCTGCGATATGCCTCGGGGAGCTGTCAACCGAGCGTGGATCCGAGGATTTCCG

AATGGGGAAACCCAG

B.2多重實時熒光PCR檢測

B.2.1總DNA的提取

見正文第7部分“細菌DNA的提取”。

B.2.2多重實時熒光PCR反應(yīng)體系（探針熔解曲線法）

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B.2.2.1多重實時熒光PCR方法（探針熔解曲線法）原理

本方法采用熒光PCR探針熔解曲線法，其基本原理是：在PCR體系中加入兩端分別標(biāo)記有熒光基團與

淬滅基團的探針，在PCR過程中擴增出與探針序列互補的單鏈寡核苷酸序列，在擴增完成后增加熔解曲

線分析過程，同時實時監(jiān)測熒光值的變化，通過計算熒光值與溫度的負導(dǎo)數(shù)，可獲得探針與該序列雜交

產(chǎn)物的熔解曲線，并得出熔點（Tm值）。因此，根據(jù)不同分枝桿菌ITS片段的特異序列設(shè)計探針，采用

特定的熒光通道和熔點進行分枝桿菌的鑒別。同時在體系中加入外源性內(nèi)控模板，對擴增體系進行質(zhì)量

控制。以含結(jié)核分枝桿菌的質(zhì)粒材料作為陽性對照，以不含分枝桿菌的DNA溶解液作為陰性對照。

B.2.2.2多重實時熒光PCR反應(yīng)體系

多重實時熒光PCR反應(yīng)體系見表B.1。

表B.1PCR反應(yīng)體系

名稱加樣量/μL

PCRMix19.6

DNA聚合酶混合液0.4

模板DNA5.0

合計25

B.2.2.3反應(yīng)體系配液過程

1首先將除酶混合液外的所有試劑從冰箱取出并平衡至室溫。

PCR反應(yīng)液配液標(biāo)準(zhǔn)為：分別取n×19.6μLPCRMix和n×0.4μLDNA聚合酶混合液加入到1.5

mL離心管中，將離心管輕震混勻，3000g離心數(shù)秒。配好的PCR反應(yīng)液必須貯存在8℃以下并在4小

時內(nèi)使用。

②分裝PCR反應(yīng)液：PCR反應(yīng)液以每管20μL分裝于PCR薄壁反應(yīng)管。

③將配制好的PCR反應(yīng)管裝入自封袋轉(zhuǎn)移至提取間。貯存在8℃以下直至樣品提取處理完畢。

注：每次實驗應(yīng)設(shè)置陽性和陰性對照進行質(zhì)量控制。

④用微量加液器向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入相應(yīng)的提取樣品或陰性/陽性對照5μL。立即蓋嚴(yán)管蓋。

⑤將已加入模板的PCR薄壁反應(yīng)管瞬時離心數(shù)秒，除去氣泡，并轉(zhuǎn)移至PCR擴增區(qū)。

B.2.2.4多重實時熒光PCR擴增及熔解曲線分析

擴增與熔解曲線分析步驟為一個程序，在SLAN-96S熒光PCR儀上連續(xù)完成。

①反應(yīng)程序設(shè)定如下：

體系本試劑盒反應(yīng)體系設(shè)為25μL

PCR反應(yīng)階段條件循環(huán)數(shù)

程序UNG酶處理50℃2分鐘1

·

XX/TXXXXX—XXXX

預(yù)變性95℃10分鐘1

95℃15秒

PCR循環(huán)程序57℃20秒55

78℃20秒

保溫40℃30分鐘1

95℃2分鐘

熔解分析40℃2分鐘

1

程序40℃～90℃，采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道

熒光信號，連續(xù)采光，升溫速率0.04℃/S

②程序運行完畢，將PCR薄壁反應(yīng)管（閉管）取出放入密封袋，將封口封嚴(yán)，按污染源處理。

B.2.3結(jié)果判斷與描述

樣品檢測時，檢測流程及結(jié)果判定按照下述原則進行：

樣品提取后采用檢測試劑進行檢測，同時需要檢測陽性對照和陰性對照；當(dāng)單次實驗結(jié)果的陽性對

照和陰性對照的數(shù)值在參考值范圍內(nèi)，則單次實驗有效，可進行樣品類型的分析和判讀。

B.2.3.1結(jié)果分析條件設(shè)定