新版高中生物第2節(jié) 基因工程的基本操作程序

第3章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序人教版高中生物學(xué)習(xí)目標(biāo)闡述基因工程的原理和基本操作及PCR的基本操作。1.文化基礎(chǔ)：明確基因工程的操作步驟及PCR擴增技術(shù)的應(yīng)用。2.自主發(fā)展：嘗試進行PCR擴增獲取產(chǎn)品。3.社會參與：利用基因工程技術(shù)和方法獲得人類生產(chǎn)或生活所需產(chǎn)品。

自上個世紀(jì)90年代以來，由于棉鈴蟲在我國大部分棉區(qū)持續(xù)性大發(fā)生或爆發(fā)，給棉花生產(chǎn)帶來了巨大的威脅，棉農(nóng)談“蟲”色變，僅1992年一年即造成直接經(jīng)濟損失60多億元，間接損失超過100億元，對整個國民經(jīng)濟發(fā)展造成了很大影響。同時由于棉鈴蟲的大爆發(fā)，防蟲治蟲使棉花的生產(chǎn)成本增加，植棉的比較效益降低。1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國己育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益450億元。閱讀P76—83，回答下列問題2.基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟?3.基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些?1.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎?培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟?

培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉主要需要四個步驟:_________________________、基因表達載體的構(gòu)建、_________________________________、目的基因的檢測與鑒定。目的基因的篩選與獲取將目的基因?qū)耸荏w細胞一、目的基因的篩選與獲取1．目的基因(1)概念：用于改變___________________或獲得____________________等的基因。受體細胞性狀預(yù)期表達產(chǎn)物(2)實例：培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因是____________________。Bt抗蟲蛋白基因2．篩選合適的目的基因(1)較為有效的方法：從相關(guān)的__________________和________________的基因中進行篩選。(2)實例：在培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉之前，科學(xué)家不僅掌握了Bt基因的序列信息，也對Bt基因的表達產(chǎn)物___________________有了較為深入的了解。(3)認識基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法：____________________技術(shù)、遺傳序列數(shù)據(jù)庫、_______________________工具。已知結(jié)構(gòu)功能清晰Bt抗蟲蛋白DNA測序序列比對3．利用PCR獲取和擴增目的基因(1)PCR的含義：PCR是________________________的縮寫，它是一項根據(jù)________________________的原理，在體外提供_________________的各種組分與反應(yīng)條件，對______________________________進行大量復(fù)制的技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制參與DNA復(fù)制目的基因的核苷酸序列(2)條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種______________、四種____________________、______________________________。引物脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶引物是一小段能與________________的一段堿基序列________________的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸。DNA母鏈互補配對(3)PCR反應(yīng)的過程①變性：溫度上升到90℃以上，目的基因DNA_______________________________。受熱變性后解為單鏈DNA模板待擴增的DNA模板PCR擴增儀（900C以上）引物引物與兩條單鏈DNA結(jié)合PCR擴增儀（500C左右）②復(fù)性：溫度下降到50℃左右時，_________________通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。兩種引物PCR擴增儀（720C左右）耐高溫的DNA聚合酶③延伸：溫度上升到72℃左右時，溶液中_______________________在耐高溫的_______________________的作用下加到引物的________端合成子鏈。四種脫氧核苷酸DNA聚合酶3′④重復(fù)循環(huán)多次。第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為______________反應(yīng)的____________，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物。第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為______________反應(yīng)的____________，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)的產(chǎn)物。⑤結(jié)果：每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍，即成_____________形式擴增(約為2n)。指數(shù)第二輪模板第三輪模板(4)PCR技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較項目PCR技術(shù)DNA復(fù)制

區(qū)別解旋方式場所酶DNA在高溫作用下變性解旋解旋酶催化細胞外(在PCR擴增儀內(nèi))細胞內(nèi)(主要在細胞核內(nèi))耐高溫的的DNA聚合酶(Taq聚合酶)DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等

區(qū)別

溫度條件合成的對象聯(lián)系需控制溫度，在較高溫度下進行細胞內(nèi)溫和條件DNA片段或基因DNA分子①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質(zhì)合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸(5)思考與討論用PCR可以擴增mRNA嗎？提示：mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行擴增。由mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過程是:第一步，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子;第二步，核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。二．基因表達載體的構(gòu)建1.

基因表達載體是載體的一種，除______________、標(biāo)記基因外，還必須有啟動子、終止子等。2.啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的_______________，位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,最終表達出人類需要的蛋白質(zhì)。3.終止子相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的_________________。目的基因DNA片段DNA片段首先用一定的__________________切割載體，使它出現(xiàn)一個切口，然后用_______________限制酶或_______________________的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用______________________將目的基因片段拼接到載體的切口處。限制酶同種能產(chǎn)生相同末端DNA連接酶限制酶切割位點限制酶限制酶DNA連接酶三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1．轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)___________和_________________的過程。維持穩(wěn)定表達2．目的基因?qū)胧荏w細胞的方法將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細胞不是更簡便嗎?如果這么做，效果會怎樣?思考與討論提示：有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物的總DNA提取出來，通進注射或花粉管通道法導(dǎo)人受體植物，沒有進行基因表達載體的構(gòu)建。這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定哪些基因?qū)肆耸荏w植物。受體細胞方法說明特點植物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染植物細胞→將目的基因整合到植物細胞染色體的DNA上→目的基因表達經(jīng)濟、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞→目的基因表達簡便、經(jīng)濟，我國科學(xué)家獨創(chuàng)的一種方法動物細胞微生物細胞顯微注射技術(shù)Ca2＋處理法(感受態(tài)細胞法)將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)→獲得具有新性狀的動物將目的基因?qū)雱游锛毎顬橛行У姆椒ㄓ肅a2＋處理微生物細胞→感受態(tài)細胞→將基因表達載體與感受態(tài)細胞混合→在一定溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子簡便、經(jīng)濟、有效四、目的基因的檢測與鑒定1．分子水平檢測(1)通過_________________等技術(shù)檢測受體細胞染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。PCR(2)從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)用相應(yīng)的抗體進行__________________雜交，檢測目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì)。抗原—抗體2．個體水平鑒定包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性及抗性程度?；蚬こ坍a(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品活性進行比較等。

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在世界范圍內(nèi)被廣泛種植，有效控制了棉鈴蟲的種群數(shù)量，顯著減少了農(nóng)藥的用量。面對棉鈴蟲的危害，有了抗蟲棉是否就可以一勞永逸、高枕無憂呢?根據(jù)棉鈴蟲對傳統(tǒng)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的發(fā)展歷史，科研人員推測棉鈴蟲存在對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的可能。請你查閱資料，了解以下問題。1.在實際種植過程中,棉鈴蟲是否對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性?證據(jù)是什么?2.科研工作者在沒有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對。他們想出的延竣棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些?這些措施的原理是什么?有效嗎?到社會中去

提示:1.這是一個開放性的問題，需要學(xué)生在找資料來回答。隨著田向監(jiān)測數(shù)據(jù)的更新及新的科研論文發(fā)表，每年學(xué)生獲得的證據(jù)是不樣的。例如，科研人員對長江流城種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉進行了監(jiān)測2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平;2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標(biāo)害蟲格鈴蟲、紅鈴蟲等井未對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度連國的多個實驗室中，通過毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。教師要注意引導(dǎo)學(xué)生搜集科學(xué)、可靠的證據(jù)，如科研論文、權(quán)威的官方報道等。2.科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。(1)基因策略；（2）田間策略；（3）國家宏觀調(diào)控策略。五、探究與實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定結(jié)果分析與評價提示：可以通過在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結(jié)果。1.你是否成功擴增出DNA片段?判斷的依據(jù)是什么?2.你進行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶?如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因。提示：如果擴增不成功，可能的原因有:漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有:引物設(shè)計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚體;退火溫度過低;DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。六、總結(jié)和練習(xí)1．下列關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細胞的描述，不正確的是(

)A．培育“黃金大米”可用花粉管通道法導(dǎo)入目的基因B．顯微注射技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動物中采用最多的方法C．目的基因?qū)氪竽c桿菌最常用的方法是Ca2＋處理法D．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛毎畛Ｓ玫姆椒ㄌ崾荆核镜幕ê苄?，不適合用花粉管通道法導(dǎo)入目的基因，A錯誤；將目的基因?qū)雱游锛毎Ｓ蔑@微注射法，B正確；將目的基因?qū)胛⑸锛毎畛Ｓ玫姆椒ㄊ怯肅a2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)，C正確；將目的基因?qū)胫参锛毎畛Ｓ玫姆椒ㄊ寝r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，此外還有基因槍法和花粉管通道法，D正確。A2．農(nóng)桿菌侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA插入植物基因組中。圖示為利用農(nóng)桿菌培育轉(zhuǎn)基因植物的基本流程，請據(jù)圖回答：(1)剪除Ti質(zhì)粒的某些片段、替換復(fù)制原點O與添加抗生素的抗性基因T的過程①中，需用多種限制酶處理，原因是__________________________________________，需用_______________