儀器分析-氣相色譜

第一章氣相色譜分析

第一節(jié)色譜概述

色譜法是一種重要的分離方法，這種方法用到分析化學(xué)中，就是色譜分析。它具有高分離效能，高檢測(cè)性能，分析速度快的特點(diǎn)。因而成為現(xiàn)代儀器分析方法中應(yīng)用最廣泛的方法Clarus600氣質(zhì)聯(lián)用儀是PerkinElmer公司2006年推出的最新型氣質(zhì)聯(lián)用儀

2008奧運(yùn)食品安全移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室

色譜法早在1903年由俄國植物學(xué)家茨維特分離植物色素時(shí)采用。他在研究植物葉的色素成分時(shí)，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為色譜法。以后此法逐漸應(yīng)用于無色物質(zhì)的分離，“色譜”二字雖已失去原來的含義，但仍被人們沿用至今。1、色譜的概念

在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動(dòng)的一相（固體或液體）稱為固定相

；自上而下運(yùn)動(dòng)的一相（一般是氣體或液體）稱為流動(dòng)相

；裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜柱

。2、色譜分離的基本原理當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。3、色譜法分類：

a.按兩相狀態(tài)分類氣體為流動(dòng)相的色譜稱為氣相色譜（GC）

根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體），又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC）。液體為流動(dòng)相的色譜稱液相色譜（LC）同理液相色譜亦可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）。超臨界流體為流動(dòng)相的色譜為超臨界流體色譜（SFC）。

b.按分離機(jī)理分類利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為分配色譜法。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法，稱為離子交換色譜法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，稱為凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。最近，又有一種新分離技術(shù)，利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進(jìn)行分離的技術(shù)稱為親和色譜法，常用于蛋白質(zhì)的分離。14高效毛細(xì)管電泳：九十年代快速發(fā)展出的一種分析儀器，主要是利用電泳原理進(jìn)行分離、特別適合生物試樣分析。15色譜法分類柱色譜平板色譜173.色譜法的特點(diǎn)（1）分離效率高

復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體，手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高

可以檢測(cè)出μg·g-1(10-6)級(jí)甚至ng·g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。（3）分析速度快

一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。（4）應(yīng)用范圍廣

氣相色譜：沸點(diǎn)<400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

不足之處：被分離組分的定性較為困難。184、色譜一般結(jié)構(gòu)1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計(jì)；6-壓力表；4-針形閥；5-流量計(jì)；6-壓力表；7-進(jìn)樣器；8-色譜柱；9-熱導(dǎo)檢測(cè)器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀。19色譜流出曲線和色譜峰由檢測(cè)器輸出的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。5、色譜基本參數(shù)與流出曲線的表征20（1）基線

無試樣通過檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即為基線。a.基線漂移b.基線噪音21信號(hào)進(jìn)樣空氣峰ha色譜流出曲線色譜峰（2）峰高色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以（h）表示。22

（3）保留值

a.時(shí)間表示的保留值

保留時(shí)間(tR)：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間；

死時(shí)間(tM)：不與固定相作用的氣體(如空氣)的保留時(shí)間；

23

因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相流動(dòng)速度相近。測(cè)定流動(dòng)相平均線速ū時(shí)，可用柱長L與tM的比值計(jì)算，即

ū=L/tM24調(diào)整保留時(shí)間tR′某組分的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后，稱為該組分的調(diào)整保留時(shí)間，即tR′=tR

tM

由于組分在色譜柱中的保留時(shí)間tR包含了組分隨流動(dòng)相通過柱子所需的時(shí)間和組分在固定相中滯留所須的時(shí)間，所以tR實(shí)際上是組分在固定相中保留的總時(shí)間。2526

保留時(shí)間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時(shí)間常受到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保留體積來表示保留值。27死體積V0

指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和。當(dāng)后兩項(xiàng)很小可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與色譜柱出口的載氣流速qVo（cm3·min-1）計(jì)算。

b.用體積表示的保留值28

V0=tMqVo

式中qVo為色譜柱出口的載氣流量。29保留體積VR指從進(jìn)樣開始到被測(cè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過的流動(dòng)相的體積。保留時(shí)間與保留體積關(guān)系：

VR=tR

qVo

306.調(diào)整保留體積VR

某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。

VR

=VR

V0=tR

qVo

31(4)

相對(duì)保留值r21

組分2與組分1調(diào)整保留值之比：

r21=t′R2

/t′R1=V′R2/V′R1

相對(duì)保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對(duì)這兩種組分的選擇性。32(5)區(qū)域?qū)挾群饬可V峰寬度的參數(shù)，從分離角度著眼，希望區(qū)域?qū)挾仍秸胶?，三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差(

)：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354

。（3）峰底寬(Wb)：Wb=4

。33從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：

(i)根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)；(ii)根據(jù)色譜峰的保留值，可以進(jìn)行定性分析；(iii)根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析；(iv)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)；(v)色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相（或流動(dòng)相）選擇是否合適的依據(jù)。34351、典型氣相色譜的構(gòu)成I載氣系統(tǒng)II進(jìn)樣系統(tǒng)III色譜柱和柱箱，包括溫度控制裝置IV檢測(cè)裝置V記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第二節(jié)氣相色譜分析理論基礎(chǔ)36

1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計(jì)；6-壓力表；4-針形閥；5-流量計(jì)；6-壓力表；7-進(jìn)樣器；8-色譜柱；9-熱導(dǎo)檢測(cè)器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀。37I

載氣系統(tǒng)

包括氣源、凈化干燥管和載氣流速控制。常用的載氣有：氫氣、氮?dú)?、氦氣。凈化干燥管：去除載氣中的水、有機(jī)物等雜質(zhì)（依次通過分子篩、活性炭等）。載氣流速控制：壓力表、流量計(jì)、針形穩(wěn)壓閥，控制載氣流速恒定。38II

進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣裝置：進(jìn)樣器，氣化室。氣體進(jìn)樣器（六通閥）：

推拉式和旋轉(zhuǎn)式兩種。試樣首先充滿定量管，切入后，載氣攜帶定量管中的試樣氣體進(jìn)入分離柱。39液體進(jìn)樣器：

不同規(guī)格的專用注射器，填充柱色譜常用10μL；毛細(xì)管色譜常用1μL；新型儀器帶有全自動(dòng)液體進(jìn)樣器，清洗、潤沖、取樣、進(jìn)樣、換樣等過程自動(dòng)完成，一次可放置數(shù)十個(gè)試樣。

氣化室：將液體試樣瞬間氣化的裝置。無催化作用。40III

色譜柱和柱箱，包括溫度控制裝置

色譜柱：色譜儀的核心部件。柱材質(zhì)：不銹鋼管或玻璃管，內(nèi)徑3～6毫米。長度可根據(jù)需要確定。柱填料：粒度為60～80或80～100目的色譜固定相。

氣-固色譜：固體吸附劑氣-液色譜：擔(dān)體+固定液柱制備對(duì)柱效有較大影響，填料裝填太緊，柱前壓力大，流速慢或?qū)⒅滤?，反之空隙體積大，柱效低。有關(guān)固定液性質(zhì)及其選擇見下一節(jié)。41溫度控制系統(tǒng)

溫度是色譜分離條件的重要選擇參數(shù)；氣化室、分離室、檢測(cè)器在操作時(shí)均需控制溫度；氣化室：保證液體試樣瞬間氣化；檢測(cè)器：保證被分離后的組分通過時(shí)不在此冷凝；

分離室：準(zhǔn)確控制分離需要的溫度。當(dāng)試樣復(fù)雜時(shí)，分離室溫度需要按一定程序控制溫度變化，各組分在最佳溫度下分離。42IV

檢測(cè)系統(tǒng)

通常由檢測(cè)元件、放大器、顯示記錄三部分組成；被色譜柱分離后的組分依次進(jìn)入檢測(cè)器，按其濃度或質(zhì)量隨時(shí)間的變化，轉(zhuǎn)化成相應(yīng)電信號(hào)，經(jīng)放大后記錄和顯示，給出色譜圖。

檢測(cè)器：廣普型——對(duì)所有物質(zhì)均有響應(yīng)；

專屬型——對(duì)特定物質(zhì)有高靈敏響應(yīng)。

常用的檢測(cè)器：熱導(dǎo)檢測(cè)器、氫火焰離子化檢測(cè)器；有關(guān)檢測(cè)器原理、結(jié)構(gòu)見第五節(jié)。432、氣相色譜柱及固定相的種類分離系統(tǒng)由色譜柱組成，它是色譜儀的核心部件，其作用是分離樣品。色譜柱主要有兩類：填充柱和毛細(xì)管柱。

1）填充柱填充柱由不銹鋼或玻璃材料制成，內(nèi)裝固定相，一般內(nèi)徑為2～6mm，長0.5～10m。填充柱的形狀有U型和螺旋型二種。442）毛細(xì)管柱毛細(xì)管柱又叫空心柱，分為涂壁，多孔層和涂載體空心柱。涂壁空心柱是將固定液均勻地涂在內(nèi)徑0.l～0.5mm的毛細(xì)管內(nèi)壁而成，毛細(xì)管材料可以是不銹鋼，玻璃或石英。

毛細(xì)管色譜柱滲透性好，傳質(zhì)阻力小，而柱子可以做到長幾十米。與填充往相比，其分離效率高（理論塔板數(shù)可達(dá)106）、分析速度塊、樣品用量小，但柱容量低、要求檢測(cè)器的靈敏度高，并且制備較難。45分離系統(tǒng)色譜柱填充柱（2-6mm直徑，0.5-10m長）毛細(xì)管柱（0.1-0.5mm直徑,幾十米長）固定相固體固定相：固體吸附劑液體固定相：由擔(dān)體和固定液組成46（1）固體固定相： 氣-固色譜中固定相是一種具有多孔及較大表面積的固體吸附劑，包括活性碳、硅膠、Al2O3、分子篩等；47氣體分子為什么能被固體表面吸附呢?固體表面的分子與內(nèi)部分于不同，存在剩余的表面自由力場，當(dāng)氣體分子碰到固體表面時(shí)，其中一部分就被吸附，并釋放出吸附熱，在被吸附的分子中，只有當(dāng)其熱運(yùn)動(dòng)的動(dòng)能足以克服吸附劑力場的位壘時(shí)才能重新回到氣相，所以在與氣體接觸的固體表面上，總是保留著許多被吸附的分子。48氣-液色譜中的固定相是在化學(xué)惰性的固體微粒（也稱擔(dān)體）的表面涂一層高沸點(diǎn)的有機(jī)化合物的液膜（2）液體固定相擔(dān)體固定液49

色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來研究色譜行為。

3、色譜分離的基本原理50a.分配系數(shù)（partionfactor）K

組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。51分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時(shí)，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。52分配比（partionradio）k一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比。

1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時(shí)間越長。3.分配比可以由實(shí)驗(yàn)測(cè)得。分配比也稱：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；53容量因子與分配系數(shù)的關(guān)系

式中β為相比。填充柱相比：6～35；毛細(xì)管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保留時(shí)間越長。

VM為流動(dòng)相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；

VS為固定相體積，對(duì)不同類型色譜柱，VS的含義不同；

氣-液色譜柱：VS為固定液體積；

氣-固色譜柱：VS為吸附劑表面容量。54分配比與保留時(shí)間的關(guān)系

滯留因子（retardationfactor）：us：組分在分離柱內(nèi)的線速度；u：流動(dòng)相在分離柱內(nèi)的線速度；滯留因子RS也可以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω表示：

若組分和流動(dòng)相通過長度為L的分離柱，需要的時(shí)間分別為tR和tM，則：55tR=tM(1+k)通過上式可直接由實(shí)驗(yàn)獲得的保留值求出分配比。

56分離因子

分離因子（也稱為選擇性因子）也可用來衡量兩物質(zhì)的分離程度，用α表示。

57

如果兩組分的K或k值相等，則α=1，兩個(gè)組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。58

b.塔板理論（platetheory）5960

從溶質(zhì)在氣液兩相間的平衡分配出發(fā)，把色譜柱類比為精餾塔，借用理論塔板的概念，以多級(jí)平衡的分離過程來解釋色譜分離過程。把色譜柱看成由n個(gè)小段組成，在每一小段內(nèi)，一部分空間被涂在擔(dān)體上的液相占據(jù)，一部分充滿了載氣，載氣占據(jù)的空間被稱為板體積ΔV。溶質(zhì)在氣液兩相間很快能夠達(dá)到分配平衡，這一小段色譜柱稱為一個(gè)理論塔板，其長度稱為理論板高，用符號(hào)H表示，色譜柱長為L，柱內(nèi)相當(dāng)?shù)睦碚摪鍞?shù)記為

nn=L/H61(1)將載氣看作成脈動(dòng)（間歇）過程，每次進(jìn)氣為一個(gè)板體積；(2)在每一個(gè)過程間隔內(nèi)，分析物在氣液兩相間的平衡迅速達(dá)到；(3)試樣開始都是加在0號(hào)塔板上，試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略；(4)

分配系數(shù)K不變

塔板理論的假設(shè)62色譜柱長：L，

虛擬的塔板間距離(高度)：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：

n=L/H63組分分布計(jì)算設(shè)分配比k=1,色譜柱由5塊塔板組成,進(jìn)樣量1mg

64色譜流出圖當(dāng)n>50時(shí)，就可以得到峰形對(duì)稱的曲線65信號(hào)時(shí)間色譜流出圖氣相色譜中，塔板數(shù)約1000-100000066色譜流出曲線的數(shù)學(xué)描述色譜峰為正態(tài)分布時(shí)，色譜流出曲線上的濃度與時(shí)間的關(guān)系為：67理論塔板數(shù)和理論塔板高度68

有效塔板數(shù)和有效塔板高度組分在tM時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：69

塔板理論的特點(diǎn)和不足*(1)當(dāng)色譜柱長度一定時(shí)，塔板數(shù)n

越大(塔板高度H越小)，被測(cè)組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)。(3)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時(shí)，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。(5)塔板理論無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。70ＶanDeemter方程的數(shù)學(xué)簡化式為

H=A+B/u+Cuu：流動(dòng)相線速度；A、B、C常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散系項(xiàng)數(shù)、分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。速率理論-影響柱效的因素H：理論塔板高度;

71A─渦流擴(kuò)散項(xiàng)（多路徑項(xiàng)）72A─渦流擴(kuò)散項(xiàng)

在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動(dòng)相向柱出口遷移時(shí)，流動(dòng)相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動(dòng)方向，使組分分子在前進(jìn)中形成紊亂的類似渦流的流動(dòng)，故稱渦流擴(kuò)散;由于填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長短不一，因而同時(shí)進(jìn)色譜柱的相同組分到達(dá)柱口時(shí)間并不一致，引起了色譜峰的變寬。（多路徑項(xiàng)）73A─渦流擴(kuò)散項(xiàng)dp：固定相的平均顆粒直徑;

固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。

A=2λdp

λ：固定相的填充不均勻因子;74

上式表明，A與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子λ有關(guān)，與流動(dòng)相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關(guān)。為了減少渦流擴(kuò)散，提高柱效，使用細(xì)而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對(duì)于空心毛細(xì)管，不存在渦流擴(kuò)散，因此A=0。75B/u—分子擴(kuò)散項(xiàng)縱向分子擴(kuò)散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。它隨著流動(dòng)相向前推進(jìn)，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)的向前和向后擴(kuò)散，造成譜帶展寬?？v向擴(kuò)散與組分在柱內(nèi)的保留時(shí)間有關(guān)76B/u（縱向分子擴(kuò)散項(xiàng)）——指分子沿色譜柱軸向擴(kuò)散引起的色譜譜帶展寬B=2γDg式中：γ——彎曲因子，填充柱γ

<1

空心柱γ=1Dg——組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)

由于組分在液相中的擴(kuò)散系數(shù)只有氣體中的1/105，因此在液相色譜中B可以忽略。77

γ是填充柱內(nèi)流動(dòng)相擴(kuò)散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對(duì)自由分子擴(kuò)散的阻礙情況。Dg為組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)（cm3·s-1）,分子擴(kuò)散項(xiàng)與組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)Dg成正比.

γ：彎曲因子，填充柱色譜，γ<1。78Dg與流動(dòng)相及組分