醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗指導(dǎo)：凝集反應(yīng)

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗指導(dǎo)：凝集反應(yīng)內(nèi)容：四、直接凝集反應(yīng)玻片凝集反應(yīng)—細菌的鑒定、ABO血型鑒定試管凝集反應(yīng)五、間接凝集反應(yīng)正向間接凝集反應(yīng)—間接凝集乳膠試驗、間接血凝試驗反向間接凝集反應(yīng)—反向間接血凝試驗、協(xié)同凝集試驗間接凝集抑制試驗試驗、直接凝集反應(yīng)（Directagglutinationreaction）細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒性抗原，在適當電解質(zhì)參與下直接與相應(yīng)的抗體結(jié)合形成肉眼可見的凝集塊，稱為直接凝集反應(yīng)。常用的直接凝集試驗有玻片法和試管法兩種。㈠玻片凝集反應(yīng)（Slideagglutinationtest）玻片凝集反應(yīng)是將已知的抗體直接與未知的顆粒性抗原物質(zhì)（如細菌，紅細胞等）在玻片上混合，在有適當?shù)碾娊赓|(zhì)存在的條件下，如兩者對應(yīng)便發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見凝集物，即為陽性；如兩者不對應(yīng)，便無凝集物出現(xiàn)，即為陰性。此法屬定性試驗，主要用于細菌鑒定和分型、人類紅細胞ABO血型的鑒定等。細菌的鑒定：【材料】⑴1∶20稀釋的傷寒桿菌的診斷血清。⑵傷寒桿菌、大腸桿菌18~24小時培養(yǎng)物、生理鹽水。⑶潔凈載玻片、接種環(huán)、酒精燈、記號筆等?！痉椒ā竣湃崈糨d玻片一張，用記號筆劃分為三格，并依次編號為1、2、3。⑵用滅菌的接種環(huán)取生理鹽水于玻片的三格內(nèi)，各加2~3環(huán)。⑶將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒灼滅菌，冷卻后自平皿挑取少量大腸桿菌置于第2格生理鹽水中混勻。然后，同法分別取少許傷寒桿菌于第1格及第3格，與生理鹽水混勻。⑷用滅菌接種環(huán)于第2格加傷寒桿菌診斷血清2~3環(huán)并混勻，同法取傷寒桿菌診斷血清2~3環(huán)，加于第1格中混勻。⑸輕搖玻片，靜置1~2分鐘后，觀察結(jié)果，【結(jié)果】如上述混合懸液由均勻混濁狀變?yōu)槌吻逋该?，并出現(xiàn)大小不等的乳白色凝集塊者為陽性；如混合物仍呈均勻混濁，無凝集物者為陰性。【注意事項】⑴每一待檢菌均須作生理鹽水對照，如對照凝集則表示細菌發(fā)生自凝，試驗無效。⑵取細菌培養(yǎng)物時，不宜過多。與診斷血清或生理鹽水混合時，必須將細菌涂散，涂均勻，但不宜涂得太寬，以免很快干涸而影響結(jié)果。⑶傷寒桿菌為腸道致病菌，在實驗中務(wù)必嚴格無菌操作，遵守實驗規(guī)則，用后的載玻片應(yīng)立即放入盛有消毒劑的容器內(nèi)。⒉ABO血型鑒定【材料】⑴抗A標準血清、抗B標準血清。⑵載玻片、采血針、碘酒和酒精棉球、牙簽、生理鹽水、毛細吸管等?！痉椒ā竣湃崈糨d玻片一張，用記號筆分為兩格，于上角分別注明A、B字樣。⑵用毛細吸管取生理鹽水于玻片的兩格內(nèi)各加一滴。⑶用碘酒酒精棉球消毒耳垂或手指尖，采血1~2滴混入玻片上的生理鹽水中，迅速用牙簽混勻，制成血球懸液。⑷在兩格血球懸液中分別加抗A標準血清和抗B標準血清一滴，分別用牙簽兩端攪拌混勻，2~5分鐘后搖晃玻片，觀察結(jié)果。？【結(jié)果】混合液由均勻紅色混濁狀逐漸變?yōu)橥该?，并出現(xiàn)大小不等的紅色凝集塊者即為紅細胞凝集；若混合液仍呈均勻混濁狀，無凝集塊，則表明紅細胞未發(fā)生凝集。血型鑒定試驗結(jié)果及鑒定見表表血型鑒定試驗結(jié)果判定診斷血清血型抗A抗BA＋－B－＋AB＋＋O－－“＋”表示凝集“－”表示不凝集【注意事項】⑴試驗用載玻片要清潔，并務(wù)必注明A和B字樣。⑵待檢紅細胞懸液不宜過稀或過濃。⑶要及時觀察結(jié)果，以防時間過長使標本干涸而影響結(jié)果的觀察和判定。㈡試管凝集試驗本試驗是用已知的顆粒性抗原來檢測未知的抗體及其相對含量，此法屬定量試驗。方法是用生理鹽水將待測血清在試管中進行連續(xù)倍比稀釋，然后于各管中加入等量的已知抗原懸液，經(jīng)過一定時間后，觀察有無凝集并根據(jù)凝集程度判定血清抗體的效價?！静牧稀竣眰畻U菌H菌液。⒉傷寒桿菌免疫血清（1∶10稀釋）。⒊生理鹽水、小試管、試管架、1ml和5ml刻度吸管等?！痉椒ā竣比崈粜≡嚬?支列于試管架上，依次編號。⒉用5ml吸管吸取生理鹽水，每管內(nèi)加入0.5ml。⒊用1ml吸管吸取待檢血清0.5ml加入第1管，吹吸3次，充分混勻后，吸出0.5ml加入第2管，如上依次稀釋至第7管，自第7管吸出0.5ml棄去。第8管不加血清作為對照管。見圖4．用5ml吸管吸取傷寒桿菌菌液，從第8管起向前加，每管加入0.5ml。5．搖勻后，置室溫或37℃24小時后，觀察結(jié)果。操作程序見表表試管凝集試驗操作程序（單位：ml）12345678生理鹽水0.50.50.50.50.50.50.50.51∶10傷寒桿菌免疫血清0.50.50.50.50.50.50.5棄去0.5傷寒桿菌H菌液0.50.50.50.50.50.50.50.5血清最終稀釋度1∶401∶801∶1601∶3201∶6401∶12801∶2560對照管室溫或37℃，24h結(jié)果【結(jié)果】⒈凝集強弱，以下列記號表示：＋＋＋＋：管內(nèi)液體澄清，細菌全部凝集于管底，輕搖有大片凝集塊。＋＋＋：管內(nèi)液體輕度混濁，細菌大部分凝集于管底，凝集塊較小。＋＋：管內(nèi)液體中度混濁，細菌部分凝集于管底，凝集塊更細小。＋：管內(nèi)液體中度混濁，僅少量細菌凝集。－：液體混濁，無凝集。若放置較長時間觀察結(jié)果，未凝集的，細菌亦可沉積于管底。與凝集塊沉淀物不同：前者是個小圓點，邊緣光滑整齊，而后者似傘狀，鋪開沉淀于管底，邊緣不整齊。⒉首先觀察第8管（對照管）。正確結(jié)果應(yīng)是管底沉淀物為圓形，邊緣整齊，輕輕振搖，細菌分散呈均勻混濁。若出現(xiàn)了非特異的凝集，則本試驗無效。⒊試驗管應(yīng)由第1管看起。H菌液凝集物呈疏松棉絮狀，沉于管底，輕搖時易離散和升起。⒋凝集效價的判定：與相應(yīng)菌液發(fā)生中等程度（＋＋）凝集的血清最高稀釋度為該被檢血清的凝集效價，用稀釋倍數(shù)表示之。如第1管仍無凝集現(xiàn)象，應(yīng)報“＜1∶40”，如第7管仍是“＋＋”或更強凝集，應(yīng)報“＞1∶2560”?！咀⒁馐马棥竣笨乖?、抗體在比例適當時，才能出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)。如果抗體的濃度過高，則無凝集物形成，此為前帶現(xiàn)象，需要在測定結(jié)果時加以鑒別。⒉判定結(jié)果時，應(yīng)在暗背景下通過強光檢查。⒊注意溫度、PH、電解質(zhì)、振搖對本試驗的影響。⒋觀察結(jié)果時，最好不要振搖試管，以免將凝集物搖散而影響他人觀察。試驗、間接凝集反應(yīng)（Indirectagglutination）間接凝集是將可溶性抗原（或抗體）吸附或偶聯(lián)在一種與免疫無關(guān)的載體顆粒表面，使其成為致敏載體，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，在電解質(zhì)存在的條件下，發(fā)生凝集。根據(jù)載體致敏時所用制劑及反應(yīng)方式，間接凝集反應(yīng)有以下幾種方法：㈠正向間接凝集反應(yīng)將已知可溶性的抗原吸附在載體顆粒表面，與相應(yīng)的抗體結(jié)合所發(fā)生的凝集稱正向間接凝集反應(yīng)，見圖。用于檢測標本中相應(yīng)的抗體，如細菌、病毒、螺旋體等以及某些自身抗體（抗核抗體、抗腎抗體、抗甲狀腺抗體等）?？捎米鬏d體的物質(zhì)有乳膠顆粒、紅細胞（人O型紅細胞、綿羊紅細胞、家兔紅細胞等）、聚苯乙烯、活性炭及硅酸鋁顆粒等。若所用載體為乳膠顆粒，則稱間接乳膠凝集試驗，若載體為紅細胞，稱為間接血凝試驗。下面分別以兩者為例進行介紹。圖正相間接凝集反應(yīng)原理示意圖⒈間接乳膠凝集試驗（Indirectlatexagglutinationtest）（玻片法）——檢測類風(fēng)濕因子類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，患者可產(chǎn)生自身抗體，即類風(fēng)濕因子（一種抗變性IgG的抗體，多為IgM類抗體）。檢測類風(fēng)濕因子可輔助診斷此病?！静牧稀竣糯龣z血清、陽性對照血清、陰性對照血清。⑵類風(fēng)濕乳膠診斷試劑（吸附有變性IgG的乳膠顆粒。將IgG經(jīng)63℃10分鐘處理，可獲得變性的IgG）。⑶載玻片、毛細滴管等?！痉椒ā竣湃崈糨d玻片一張，用標記筆劃分為3格，用毛細滴管分別向3格內(nèi)加1滴待檢血清、陽性對照血清、陰性對照血清。⑵再分別向3格內(nèi)加致敏乳膠1滴，用牙簽充分混勻后，搖動玻片2~3分鐘后，觀察結(jié)果。【結(jié)果】以肉眼觀察出現(xiàn)凝集為陽性，不出現(xiàn)凝集為陰性。玻片法為定性測定，也可以用試管法作定量測定?！咀⒁馐马棥竣旁噭?yīng)保存在4℃，切勿凍存。使用前應(yīng)使試劑接近室溫并搖勻。⑵日光燈光線不利于觀察結(jié)果。⒉間接血凝試驗(Indirecthemagglutinationtest)將可溶性抗原（細菌的提取液）吸附于紅細胞，成為抗原致敏的紅細胞，這種致敏紅細胞與相應(yīng)抗體作用可產(chǎn)生凝集現(xiàn)象?！静牧稀竣盼⒘垦澹篤型孔底，8×12孔⑵稀釋棒：一種特制的小鋁棒，下接一不銹鋼頭，中間有米形小縫，吸取量為25ul。⑶抗原致敏的紅細胞懸液、稀釋液等?！痉椒ā竣庞梦⒘考訕悠魑∠♂屢海谖⒘垦逍】變?nèi)各加25ul，每份標本做兩排，一排為測定孔，一排為對照孔。一般將受檢血清倍比稀釋至1∶64，每塊血凝板可同時檢測8份標本。⑵用稀釋棒2支蘸取受檢血清后，分別加入測定排和對照排的第1孔，雙手搓轉(zhuǎn)稀釋棒，使孔內(nèi)血清和稀釋液充分混勻，然后將稀釋棒移至第2孔，依同法按順序作對倍稀釋。⑶測定排各加稀釋液1滴，對照排各孔加抑制用抗原1滴，放微型振蕩器上振蕩1~2分鐘，蓋上一塊玻璃板，放37℃保溫1小時。⑷各孔加0.5%抗原致敏的紅細胞懸液1滴，放微型振蕩器上振蕩1分鐘，移至室溫1~2小時，觀察結(jié)果。【結(jié)果】凡紅細胞沉積于孔底，集中呈一小圓點的為不凝集。如紅細胞凝集，則分布于孔底周圍。根據(jù)紅細胞凝集程度強弱，可分為以下4級：＋＋＋＋：紅細胞形成片層凝集，均勻布滿孔底或凝集邊緣皺縮如花邊狀。＋＋＋：紅細胞形成片層凝集，面積略小于＋＋＋＋。＋＋：紅細胞形成片層凝集，面積較小，邊緣較松散。＋：紅細胞沉積于孔底，周圍有散在的少量凝集。－：紅細胞沉積于孔底，呈小圓盤點狀，邊緣清晰整齊。陰性標本表現(xiàn)為兩排均不凝集。當兩排紅細胞孔數(shù)相等時，則為非特異性的凝集?！咀⒁馐马棥竣攀褂闷鞑谋仨毲鍧?，特別是血凝板要按規(guī)定處理，否則對結(jié)果影響大。⑵受檢血清要新鮮。⑶測定一批標本時，要同時作已知陽性、陰性以及不加受檢血清的空白對照。㈡反向間接凝集反應(yīng)用特異性抗體致敏（或吸附于）載體顆粒，用于檢測標本中相應(yīng)的抗原。見圖⒈反向間接血凝試驗(Reversedindirecthemagglutinationtest)是用已知的抗體致敏紅細胞，檢測標本中相應(yīng)抗原。以檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）?！静牧稀竣?∶20抗-HBs致敏紅細胞、純化的1∶20抗-HBs、待檢血清、稀釋液。⑵“V”型微量血凝板，25ul稀釋棒、微量攪拌器、刻度吸管、滴管（40滴/ml）【方法】⑴配制致敏血球懸液：于每瓶凍干診斷血球加4ml稀釋液，輕輕旋搖使成均勻血球懸液，濃度約為0.6%。⑵正式試驗，加樣程序見表①在“V”型微量血凝板上，每份待檢血清設(shè)立8孔，于各孔內(nèi)用40滴/ml滴管各加1滴稀釋液（相當于25ul/0.025ml）。②用25ul容量的稀釋棒蘸滿待檢血清分別依在各孔內(nèi)，捻轉(zhuǎn)作對倍稀釋（一般每孔內(nèi)均需捻轉(zhuǎn)10次左右），直至第7孔，第8孔為致敏血球?qū)φ?，另設(shè)第9孔為陽性對照，加25ulHBsAg陽性血清。③于每孔加入25ul混勻的致敏血球懸液。④將血凝板置于微型振蕩器上振蕩1~2分鐘，置37℃1小時后觀察結(jié)果：表反向間接血凝試驗加樣程序（單位：ul）123456789稀釋液2525252525252525—待檢血清25252525252525棄去2525陽性血清致敏血球252525252525252525血清稀釋度1∶41∶81∶161∶321∶641∶1281∶256血球陽性對照對照37℃，1h結(jié)果不凝集：紅細胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圓點。明顯凝集（++）紅細胞于孔底形成薄膜狀凝集，中央可見疏松的紅點。出現(xiàn)明顯凝集（++）的血清最高稀釋度為HBsAg效價，凡效價≥1∶16者需進一步做中和試驗。⑶中和試驗：在血凝板上每份標本設(shè)測定排和對照排，每排8孔，于每孔加稀釋液25ul,用2支稀釋蘸被檢血清，分別在兩排作對倍稀釋至第7孔，第8孔不含血清，為血球?qū)φ?。然后，于測定排各孔加稀釋液25ul，對照排各孔加1∶20抗-HBs25ul。血凝板振蕩1~2分鐘后，置37℃30分鐘，取出，于各孔加25ul致敏血球振搖混勻，置37℃1小時后觀察結(jié)果。凡正式試驗效價≥1∶16，且中和試驗的對照排凝集孔數(shù)至少低于測定排凝集孔數(shù)2孔，為HBsAg陽性，否則系非特異性凝集?！咀⒁馐马棥竣排渲玫闹旅粞驊乙阂话阍诋斕煊猛辏糁?~10℃使用期不超過3天。⑵試驗用的血凝板、滴管、稀釋棒等器材必須十分清潔，否則易造成非特異性凝集。⑶血凝板、稀釋棒用后均需用次氯酸鈉（10%v/v）浸泡過夜；滴管需煮沸10分鐘，然后用水沖凈，再用蒸餾水沖洗，晾干備用。⒉協(xié)同凝集試驗（Coagglutinationtest）金黃色葡萄球菌細胞壁上有一種成分，稱為葡萄球菌A蛋白（StaphylococcusproteinA，SPA）。SPA能與人及各種哺乳動物（如豬、兔、豚鼠等）血清中的IgG類抗體的Fc端結(jié)合，成為致敏的載體顆粒。與SPA結(jié)合后的IgG的Fab端可與相應(yīng)的抗原結(jié)合，出現(xiàn)凝集反應(yīng)，稱為協(xié)同凝集試驗。實際上協(xié)同凝集試驗也是將已知抗體結(jié)合在載體顆粒（葡萄球菌）上，用于檢測未知抗原，故亦屬反向間接凝集反應(yīng)。【材料】⑴金黃色葡萄球菌CowanⅠ株、含0.5%福爾馬林的pH7.40.01mol/lPBS、無菌生理鹽水。⑵傷寒沙門氏菌可溶性O(shè)抗原溶液、傷寒沙門氏菌O抗原免疫血清。⑶載玻片、毛細吸管、接種環(huán)等?！痉椒ā竣臩PA菌穩(wěn)定液的制備：①取CowanⅠ菌株接種在肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置37℃培養(yǎng)18~24小時，再轉(zhuǎn)接于普通平板37℃培養(yǎng)18~24小時。②用PBS洗下菌苔，以3000r/min離心15min，洗滌3次，然后用含0.5%福爾馬林的pH7.40.01mol/lPBS稀釋成10%菌懸液，分裝保存。⑵SPA菌診斷液的制備：取上述10%SPA菌穩(wěn)定液1ml，加傷寒沙門氏菌免疫血清混勻，置37℃30分鐘，每隔10分鐘振蕩一次，以3000r/min離心15min，棄上清液，并用PBS洗滌兩次，最后加PBS至10ml。⑶取一潔凈玻片分成3格，依次編號。①于第1、2格分別加入一滴（約50ul）SPA菌診斷液，第3格加入一滴（約50ul）金黃色葡萄球菌液（未致敏SPA菌液）②于第1、3格分別加入一滴（約50ul）傷寒沙門氏菌O抗原溶液，第2格加入一滴生理鹽水。③分別用牙簽混勻，1~2分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。【結(jié)果】正確結(jié)果應(yīng)是：第1格內(nèi)金黃色葡萄球菌凝集成清晰可見的顆粒，液體澄清透明為陽性反應(yīng)結(jié)果；第2、3格為對照，無凝集。表SPA協(xié)同凝集試驗加樣程序123SPA菌診斷液SPA菌診斷液未致敏SPA菌液傷寒O抗原生理鹽水傷寒O抗原混勻后放置2分鐘＋－