《規(guī)?；馀雠．a(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷與 防治技術(shù)規(guī)程》

ICS01.040.65

CCSB04TB

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/NAIA×××-××××

規(guī)?；馀雠．a(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷與

防治技術(shù)規(guī)程

TechnicalprotocolforthediagnosisandpreventionofClostridium

perfringensinlarge-scalebeefcattlefarms

(征求意見稿)

××××-××-××發(fā)布××××-××-××實施

寧夏化學(xué)分析測試協(xié)會發(fā)布

發(fā)布

規(guī)?；馀雠．a(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷與防治技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了規(guī)?；馀雠．a(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷與防治技術(shù)的術(shù)語和定義、診斷、預(yù)防和

治療。

本文件適用于規(guī)模肉牛場牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病的防治。其他肉牛場參照執(zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用

文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）

適用于本文件。

GB4789.13食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。

GB19489實驗室生物安全通用要求。

SN/T2709國境口岸產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素檢測方法。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridiumperfringen

又名魏氏梭菌（ClostridiumWelchii），為梭狀芽胞桿菌屬，是厭氧、無動力、能產(chǎn)生芽胞的革

蘭氏陽性桿菌，在機(jī)體內(nèi)可形成莢膜。本菌廣泛存在于土壤，動物和人的腸道，通過污染的飼料和

飲水而引起動物感染發(fā)病。

3.2產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素Clostridiumperfringentoxins

產(chǎn)氣莢膜梭菌引起動物發(fā)病的因素主要由其分泌的毒素所致，根據(jù)其產(chǎn)生的毒素種類α、β、ι、

ε、CPE、NetB，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A~G七種類型，其中對人和動物致病的主要是Ａ型（產(chǎn)生α

毒素，部分菌株還產(chǎn)生腸毒素CPE），主要引起食物中毒和壞死性腸炎，甚至可以引起腸毒血癥，

造成重大影響。

2

3.3洶涌發(fā)酵（stormyfermentation）

產(chǎn)氣莢膜梭菌在牛奶培養(yǎng)基中能分解乳糖產(chǎn)酸，使酪蛋白凝固，同時產(chǎn)生大量氣體，將凝固的

酪蛋白沖成蜂窩狀，并將液面上的凡士林層向上推擠，甚至沖開管口，氣勢兇猛，是此菌的特征。

4診斷

4.1流行病學(xué)

產(chǎn)氣莢膜梭菌能使不同年齡不同品種的牛發(fā)病，主要呈零星散發(fā)或區(qū)域性流行，一年四季均有

發(fā)生，但春末、秋初及氣候突然變化時發(fā)病率明顯升高。寄生于動物體的產(chǎn)氣莢膜梭菌，內(nèi)環(huán)境因

飲食改變以及天氣變化而發(fā)生變化菌群大量繁殖并產(chǎn)生相應(yīng)的毒素，致使動物發(fā)病。

4.2臨床癥狀

在肉牛養(yǎng)殖業(yè)中多呈散發(fā)性，但病程發(fā)展快、死亡率高，主要癥狀表現(xiàn)為牛突然倒地、兩眼呆

滯、眼球突出、全身抽搐并伴有角弓反張，腹部明顯膨脹，采食和反當(dāng)機(jī)能減甚至廢絕，瘤胃、瓣

胃和網(wǎng)胃積食嚴(yán)重，皺胃嚴(yán)重擴(kuò)張。

4.3病理變化

病理剖檢變化主要為全身實質(zhì)性器官廣泛出血，腸系膜淋巴結(jié)充血腫大，肝臟質(zhì)地堅實呈土黃

色；小腸極其膨脹，腸體擴(kuò)張明顯，腸壁外觀呈暗黑色，腸腔內(nèi)充滿大量氣體；切開腸壁后，流出

黑色稠狀液體。

4.4樣本采集

剖檢后無菌采集病牛腸系膜淋巴結(jié)、肝臟及腸道組織進(jìn)行病原學(xué)診斷。樣品采集后應(yīng)盡快檢驗，

若不能及時檢驗，可在2℃～5℃保存；如8h內(nèi)不能進(jìn)行檢驗，應(yīng)-20℃保存。樣品解凍時，置于

38℃～40℃水浴解凍。

4.5分離培養(yǎng)

5%脫纖維羊血豆粉固體培養(yǎng)基配制見附錄A.1，產(chǎn)氣莢膜梭菌顯色培養(yǎng)基配制見附錄A.2，實

驗用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定。

將采集的內(nèi)臟組織表面火焰滅菌，剪取深部組織一小塊（0.5cm×0.5cm×0.5cm），在無菌條件

下，分別接種3個含有5%脫纖維羊血的豆粉固體培養(yǎng)基和3個產(chǎn)氣莢膜梭菌顯色培養(yǎng)基。將固體

培養(yǎng)基放入?yún)捬醮?，倒置?7℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，觀察菌落形態(tài)，挑取血平板培養(yǎng)基上疑

似單菌落接種于新的血平板培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24h。血平板培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出灰白色、表面濕潤、

半透明、中部凸起菌落，菌落周圍出現(xiàn)雙層溶血現(xiàn)象，內(nèi)層完全溶血，外層不完全溶血，見附錄

B.1；梭菌顯色培養(yǎng)基上出現(xiàn)若干單個橙紅色菌落，見附錄B.2。

4.6顯微鏡觀察

挑取血平板培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，為兩端頓圓、短桿狀、

藍(lán)紫色、單個或者成對排列的革蘭氏陽性菌，見附錄B中圖B.3。

4.7牛乳爆裂發(fā)酵

挑取5%脫纖維羊血固體培養(yǎng)基上的單菌落，加入含鐵牛乳培養(yǎng)基（附錄A.3）中，將凡士林

融化沿管壁加入試管中，形成密閉的厭氧環(huán)境。同條件下做一空白對照，將試管放置于37℃恒溫培

養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，觀察到產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生大量氣體將凝固的酪蛋白沖散形成蜂窩狀，并將液面上

的凡士林向上推擠，氣勢兇猛，呈現(xiàn)出“爆烈發(fā)酵”的現(xiàn)象。

4.8PCR鑒別診斷

4.8.1PCR擴(kuò)增模板制備

取液體培養(yǎng)物2mL，12000r/min離心2min，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對菌體沉淀

進(jìn)行基因組DNA的提取。

4.8.2毒素基因的PCR引物

表1毒素基因的PCR擴(kuò)增引物序列

基因引物引物序列(5’→3’)片段大小/bp

cpa-FGCTAATGTTACTGCCGTTGA

Cpa325

cpa-RCCTCTGATACATCGTGTAAG

cpb-FACTATACAGACAGATCATTCAACC

Cpb236

cpb-RTTAGGAGCAGTTAGAACTACAG

etx-FAGTATCTAATGAAATGTCCATTCC

Etx585

etx-RACTTACTTGTCCTAC

itx-FACTACTCTCAGACAAGACAG

Itx445

itx-RTTTCCTTCTATTACTATACG

netB-FATTATGTTTAGGAATACAGTTA

netB741

netB-RCAATACCCTTCACCAAATACTC

cpe-FGGAGATGGTTGGATATTAGG

Cpe233

cpe-RGGACCAGCAGTTGTAGATA

4

4.8.3PCR擴(kuò)增體系

引物cpa、cpb、etx、itx采用多重PCR，反應(yīng)體系為50μL：模板2μL，上下游引物各1μL

（10μmol/L），2×TaqMasterMix25μL，ddH2O15μL。反應(yīng)條件：94℃5min，94℃30s，52.6℃

30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。引物netB、cpe采用單項PCR，反應(yīng)體系為20

μL：模板2μL，上下游引物各1μL（10μmol/L），2×TaqMasterMix10μL，ddH2O6μL。反應(yīng)條

件：94℃5min，94℃1min，54℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。檢測過程設(shè)立

陰性對照、陽性對照和空白對照，用產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA作陽性對照模板，用非產(chǎn)氣莢

膜梭菌的細(xì)菌DNA作陰性對照，用無菌水作空白對照模板。

4.8.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物處理

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時加入DL1000DNAmaker，110V恒壓，電泳

35min左右，用凝膠成像系統(tǒng)照相記錄結(jié)果。

4.9結(jié)果判定

4.9.1產(chǎn)氣莢膜梭菌

反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時符合條件a，條件b，和條件c中的一項，否則實驗結(jié)果無效。

a)符合4.1、4.2和4.3的特征判斷為疑似病例。

b)符合4.4、4.5、4.6和4.7的特征判斷為確診病例。

c)4.8中出現(xiàn)大小為325bp的Cpa毒素擴(kuò)增帶的為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌；出現(xiàn)大小為325bp的

Cpa毒素擴(kuò)增帶，大小為236bp的Cpb擴(kuò)增帶和大小為585bp的Etx擴(kuò)增帶的為B型產(chǎn)氣莢膜梭

菌；出現(xiàn)大小為325bp的Cpa毒素擴(kuò)增帶和大小為236bp的Cpb擴(kuò)增帶的為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌；

出現(xiàn)大小為325bp的Cpa毒素擴(kuò)增帶和大小為585bp的Etx擴(kuò)增帶的為D型產(chǎn)氣莢膜梭菌；出現(xiàn)

大小為325bp的Cpa毒素擴(kuò)增帶和大小為445bp的Itx擴(kuò)增帶的為E型產(chǎn)氣莢膜梭菌；出現(xiàn)大小為

325bp的Cpa毒素擴(kuò)增帶和大小為233bp的Cpe擴(kuò)增帶的為F型產(chǎn)氣莢膜梭菌；出現(xiàn)大小為325

bp的Cpa毒素擴(kuò)增帶和大小為741bp的netB擴(kuò)增帶的為G型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

5防治措施

5.1疫苗接種防疫

一般來說抗生素對細(xì)菌病的治療是非常有療效的,但由于該菌的主要致病因素是其生長繁殖過

程中所分泌的毒素，這無疑減弱抗生素的治療效果，其次是由于抗生素的大量使用，細(xì)菌都產(chǎn)生了

耐藥性，產(chǎn)氣莢膜梭菌也不例外。所以現(xiàn)階段對該病的防治主要采用疫苗接種預(yù)防。

5.2加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

對圈舍用3%的燒堿溶液消毒，相關(guān)的器具用5%的次氯酸消毒，以此降低梭菌病的復(fù)發(fā)率。加

強(qiáng)飼料的存儲管理，飼喂過程中嚴(yán)禁飼喂霉變的飼料，合理配置飼料，避免高蛋白、高能量的飼料

過度攝入，加強(qiáng)對于畜禽糞便排泄物的處理和消毒，從源頭上消除潛在的誘發(fā)因素。國家也應(yīng)加強(qiáng)

對梭菌的流行監(jiān)測，建立相關(guān)的預(yù)防、診斷和治療的方案，徹底控制梭菌病在國內(nèi)的流行。

6

附錄A

A.1培養(yǎng)基配制

A.1.15%脫纖維羊血豆粉固體培養(yǎng)基