生物化學(xué) 核酸

第三章核酸化學(xué)第一節(jié)核酸的組成核酸按含糖的不同分為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）核酸的種類與分布DNA（脫氧核糖核酸）功能：儲存遺傳信息分布：真核細(xì)胞：細(xì)胞核內(nèi)（占98%）；原核細(xì)胞：細(xì)胞質(zhì)中的核區(qū)RNA（核糖核酸）功能：參與遺傳信息的表達(dá)分布：主要存在于細(xì)胞質(zhì)mRNA（作為模版指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成）：3-5%；分類tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸）：10-15%；rRNA（核糖體組成成分）：75-80%【注意】：遺傳信息儲存在核苷酸排序或堿基的排序中；真核細(xì)胞中的DNA占細(xì)胞DNA總量的98%以上。核苷酸是核酸的結(jié)構(gòu)單元DNA組分：脫氧核糖核苷酸RNA組分：核糖核苷酸核糖DNA中：D-2-脫氧核糖；RNA中：D-核糖【注意】：戊糖均屬于D-型糖；核酸中的核糖均為β型核糖堿基【注意】：DNA和RNA都含有胞嘧啶（C），尿嘧啶（U）只存在于RNA中，胸腺嘧啶（T）主要存在于DNA中核苷概念：嘌呤或嘧啶堿基與核糖或脫氧核糖以糖苷鍵相連稱為核苷。特征：堿基均連接在戊糖的1’位碳的半縮醛上嘌呤堿基以第九位氮，嘧啶堿基以第1’位氮連接堿基與糖平面呈垂直關(guān)系通常核酸中的核苷基本上呈反式構(gòu)象，個別片段上有順式構(gòu)象存在核糖核苷的縮寫以及結(jié)構(gòu)式：稀有核苷【注意】：假尿苷中堿基與核糖之間形成的是C-C鍵而不是N-C鍵核苷酸概念：由核苷和磷酸生成的磷酸酯核酸中常見的各種核苷酸、核苷和堿基的縮寫:RNADNA堿基核苷核苷酸堿基脫氧核苷脫氧核苷酸AAAMPADPATPAdAdAMPdADPdATPGGGMPGDPGTPGdGdGMPdGDPdGTPCCCMPCDPCTPCdCdCMPdCDPdCTPUUUMPUDPUTPTdTdTMPdTDPdTTP核苷酸可形成核苷二、三磷酸核苷一磷酸：NMP核苷二磷酸：NDP核苷三磷酸：NTPdNTP和ddNTP【注意】：核苷酸可以環(huán)化成環(huán)化核苷酸：如cAMP和cGMP（第二信使）3’，5’-環(huán)化腺苷酸：核苷酸的衍生物能量分子：ATP，GTP酶的輔因子：NAD+，NADP+，F(xiàn)AD等信息交流：GTP調(diào)節(jié)作用cAMP、cGMP第二節(jié)DNA的分子結(jié)構(gòu)DNA分子具有特定的堿基組成Chargaff定則：當(dāng)量定律：所有生物細(xì)胞的DNA中，A=T，G=C不對稱比率：不同生物RNA堿基組成不同同種生物不同組織的DNA堿基組成相同DNA的一級結(jié)構(gòu)概念：四種脫氧核糖核苷酸按一定的順序通過3’，5’-磷酸二酯鍵連接起來的直線型或環(huán)形多聚體?！咀⒁狻浚?.多核苷酸鏈具有方向性：5’→3’2.每條多核苷酸鏈都是獨一無二的。（決定因素：核苷酸排列順序或堿基排列順序）DNA一級結(jié)構(gòu)表示方法：線條式表示法（了解）字母式表示法：pA-T-C-G-OH（短線式表示法）pApTpCpGpACGTA（縮寫式）【注意】一般可在5’端標(biāo)出“p”表示5’-磷酸基團(tuán)，3’端標(biāo)出“-OH”表示3’-OH如果首端不加p，如ACGTA，則默認(rèn)DNA的5’是左端，3’是右端，核苷酸鏈方向是從5’→3’。DNA的雙螺旋DNA雙螺旋的結(jié)構(gòu)兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸向右盤繞形成右手雙螺旋。由磷酸和脫氧核糖交替排列形成的主鏈在雙螺旋的外側(cè),而嘌呤和嘧啶堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)。堿基平面與中心軸垂直,核糖平面與中心軸平行雙螺旋平均直徑2nm,螺距3.4nm,沿中心軸每旋轉(zhuǎn)一周包含10個堿基對,相鄰堿基距離為0.34nm,之間旋轉(zhuǎn)的角度為36°。(B-DNA)兩條多核苷酸鏈堿基之間,按A-T,G-C配對原則進(jìn)行配對（A-T之間形成2個氫鍵，G-C之間3個氫鍵）;兩條鏈依靠堿基之間形成的氫鍵和堿基堆積力結(jié)合在一起。螺旋結(jié)構(gòu)上有兩條螺旋形凹槽,一條較寬深,稱大溝(寬1.2nm、深0.85nm);一條較淺小，稱小溝（寬0.6nm、深0.75nm）。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論的深刻意義：確立了核酸作為信息分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，提出了堿基配對是核酸復(fù)制、遺傳信息傳遞的基本方式，從而最終確定了核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。提出了作為遺傳功能分子的DNA復(fù)制方式，半保留復(fù)制是生物體遺傳信息的最基本方式。穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素：氫鍵、堿基堆積力、離子鍵。其中堿基堆積力是最主要的穩(wěn)定因素。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多態(tài)性概念：在溶液中，DNA一般以B-DNA形式存在，但當(dāng)水合的B-DNA脫水后或溶液中加入乙醇、鹽使水的活度降低時，DNA以A-DNA形式存在，除A-DNA、BDNA外，人們還觀察到結(jié)構(gòu)參數(shù)有一定差異的其它雙螺旋DNA，這種現(xiàn)象被稱為DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多態(tài)性?！咀⒁狻浚篈-DNA、B-DNA均為右手螺旋，Z-DNA為左手螺旋生物體內(nèi)天然狀態(tài)的DNA絕大部分以B型構(gòu)象存在DNA分子超螺旋結(jié)構(gòu)概念：DNA分子在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步扭曲折疊所形成的特定構(gòu)象連接數(shù)（L）：指環(huán)形DNA分子一條鏈纏繞另一條鏈的次數(shù)超螺旋結(jié)構(gòu)的生物學(xué)意義：超螺旋能使DNA形成高度致密的狀態(tài)從而得以容納于有限的空間中超螺旋的形成可以改變雙螺旋結(jié)構(gòu)的解開程度，影響DNA分子與其他分子的相互作用，從而更好地執(zhí)行其功能三鏈四鏈DNA（了解·略）DNA的序列測定方法：酶法（Sanger法/雙脫氧法）試劑：DNA單鏈作為合成互補(bǔ)連的模板4種脫氧核苷酸三磷酸dNTP作為合成DNA的底物與模板單鏈3’端互補(bǔ)的一小段寡聚核苷酸鏈作為引物反應(yīng)的原理：DNA聚合酶按照模板鏈中的核苷酸順序，向引物的3’-OH添加dNTP，反應(yīng)形成了磷酸二酯鍵，使DNA鏈延長。Sanger向反應(yīng)體系中引入了2’，3’-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP中沒有3’-OH，因此當(dāng)ddNTP摻入到正在合成的DNA鏈中時，鏈的延伸即被終止。第三節(jié)RNA的分子結(jié)構(gòu)RNA是以3’，5’-磷酸二酯鍵連接形成的多核苷酸鏈，大多數(shù)RNA為單鏈線性分子，但通過RNA單鏈回折可在具有堿基互補(bǔ)配對區(qū)域形成局部雙螺旋結(jié)構(gòu)。RNA中的雙螺旋區(qū)通常稱為莖區(qū)，中間不形成堿基配對的單鏈區(qū)形成突環(huán)。這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)或稱發(fā)夾結(jié)構(gòu)就是RNA的二級結(jié)構(gòu)。RNA形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)類似于A型DNA結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定RNA雙螺旋區(qū)域的最主要因素仍然是堿基堆積力，其次是氫鍵。RNA據(jù)功能分類有：tRNA、mRNA、rRNAtRNA的結(jié)構(gòu)：生理功能：轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸（最主要），調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生物合成的起始，作用于DNA的反轉(zhuǎn)錄等等。結(jié)構(gòu)特點：一級結(jié)構(gòu)：分子量在25kD左右，由73-94個核苷酸殘基組成，沉降系數(shù)約4S堿基組成中有較多的稀有堿基3’-末端都為CCAOH-3’，用來接受活化的氨基酸5’-末端大多為pG。也有為pC二級結(jié)構(gòu)（tRNA的二級結(jié)構(gòu)大多呈三葉草形）?氨基酸臂?二氫尿嘧啶環(huán)?反密碼環(huán)?額外環(huán)?TψC環(huán)三級結(jié)構(gòu)（倒L形）：L形的一端為氨基酸臂，另一端為反密碼環(huán)。mRNA的結(jié)構(gòu)概念順反子（基因）：一個編碼區(qū)加上合成蛋白質(zhì)所需的調(diào)節(jié)序列，就是一個順反子。單順反子：一個mRNA分子可以編碼一條多肽鏈，這種mRNA分子被稱為單順反子多順反子：絕大多數(shù)的細(xì)菌mRNA分子可以編碼兩條或多條不同的多肽鏈，這種mRNA分子叫做多順反子。翻譯區(qū)與非翻譯區(qū)：所有的mRNA都具有翻譯區(qū)和非翻譯區(qū)這兩種序列編碼區(qū)（翻譯區(qū)）：與蛋白質(zhì)的氨基酸序列對應(yīng)的用于指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)的序列非翻譯區(qū)（UTR）：編碼區(qū)兩側(cè)序列，有3’-UTR和5’-UTR【注意】：真核生物mRNA在5’端形成帽子結(jié)構(gòu)，在3’端形成多聚腺苷酸尾的結(jié)構(gòu)真核生物mRNA的5’帽子結(jié)構(gòu)的縮寫：m7G5′ppp5′-Np（O型帽子）；m7GpppNmp（Ⅰ型帽子）、m7GpppNmpNmp（Ⅱ型帽子）（“m”代表甲基化，“N”代表任意一種核苷）3’尾端的縮寫：3′-polyA對比真核生物和原核生物mRNA的異同原核生物真核生物順反子多順反子單順反子帽子結(jié)構(gòu)與polyA尾無有內(nèi)含子與外顯子無有rRNA的結(jié)構(gòu)真核生物和原核生物的核糖體都由大小兩個亞基組成。亞基rRNA種類蛋白質(zhì)種類核糖體原核生物大亞基50S23S5S31種70S小亞基30S16S21種真核生物大亞基60S28S5.8S5S50種80S小亞基40S18S33種第四節(jié)核酸的理化性質(zhì)及分離提取核酸的理化性質(zhì)溶解性DNA與RNA微溶于水，但在鈉的水溶液中溶解度較大；不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，因此通常采用乙醇沉淀DNA。核酸的水解酸水解（對酸穩(wěn)定性）：糖苷鍵對稀酸：RNA表現(xiàn)穩(wěn)定，DNA中嘌呤形成的糖苷鍵易被酸水解，嘧啶形成的糖苷鍵不水解。磷酸二酯鍵對稀酸：不穩(wěn)定，易水解。堿水解（對堿穩(wěn)定性）：DNA中的磷酸二酯鍵對堿不敏感；RNA中的磷酸二酯鍵易被稀堿水解，水解成2’-核酸苷和3’-核酸苷酶水解（略）沉降特性蔗糖密度梯度超速離心——制備RNA的常用方法氯化銫密度梯度離心——分離DNA常用的方法粘度DNA溶液的粘度非常高，而RNA溶液的粘度要比DNA溶液小得多。DNA變性或降解時，溶液粘度均降低。紫外吸收組成核酸的嘌呤堿和嘧啶堿由于具有共軛雙鍵而具有特定的紫外吸收特性，使核酸溶液在260nm附近有最大吸收峰。利用核酸的紫外吸收可以確定核酸的純度和含量：當(dāng)提純雙鏈DNA樣品時的OD260/OD280=1.8時，說明純度很高。當(dāng)提純RNA樣品時的OD260/OD280=2.0，說明純度很高。核酸的變性與復(fù)性核酸的變性受到某些物理和化學(xué)因素的作用，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，氫鍵斷裂，堿基有規(guī)律的堆積被破壞，雙螺旋松散，雙鏈分離成兩條纏繞的無定形的多核苷酸單鏈的過程稱為變性（DNA的變性導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)的改變，不涉及磷酸二酯鍵的斷裂）變性過程：DNA的紫外吸收值增加；粘度下降；沉降系數(shù)和浮力密度增大；比旋光值降低等等增色效應(yīng)：DNA變性時，雙鏈解開變成單鏈，使堿基充分的暴露，使其紫外吸收明顯增加的現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。減色效應(yīng)：當(dāng)變性DNA重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時，堿基又處于雙螺旋的內(nèi)部，此時DNA溶液的紫外吸收降低的現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。熔解溫度：通常將增色效應(yīng)達(dá)到一半時的溫度或DNA分子有一半發(fā)生變性時的溫度稱為該DNA的熔解溫度（Tm）或熔點。與DNA的Tm值有關(guān)的因素有：DNA的均一性：均一性越高的DNA樣品，發(fā)生溶解時的溫度范圍越窄DNA的（G+C）的含量：（G+C）的含量越高的DNA，Tm值越大，在一定條件下，DNA的Tm值與（G+C）含量之間有正比關(guān)系。介質(zhì)中的離子強(qiáng)度：在離子強(qiáng)度較低的溶液中，DNA的Tm值較低，變性溫度也較寬。核酸的復(fù)性“復(fù)性”概念：變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條分開的互補(bǔ)單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。“退火”概念：將變性DNA溶液緩慢冷卻，兩條分開的單鏈可以發(fā)生互補(bǔ)序列的重新配對，復(fù)性為天然狀態(tài)的DNA，這種緩慢冷卻的過程為退火。核酸的分子雜交概念：兩條來源不同但有互補(bǔ)關(guān)系的DNA單鏈,或DNA單鏈與RNA分子,在去掉變性條件后互補(bǔ)的區(qū)段能夠退火形成雙鏈DNA分子或DNA/RNA異質(zhì)雙鏈的過程稱分子雜交。核酸的分離提?。私猓┑谖骞?jié)基因組【注意】基因是生命系統(tǒng)中最基本的信息單位，是一段DNA（有時是RNA），攜帶者合成活性產(chǎn)物的信息。基因組是細(xì)胞或生物體的全部遺傳物質(zhì)。病毒基因組（了解·略）原核生物基因組大腸桿菌的染色體基因組為環(huán)狀雙鏈DNA分子，大約有4000多個基因，基因的序列是連續(xù)的，沒有內(nèi)含子。質(zhì)粒是染色體能夠進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳單位。真核生物基因組絕大多數(shù)真核生物的基因都是不連續(xù)的，其中外顯子和內(nèi)含子交替排列，稱為割裂基因（或稱不連續(xù)基因）真核生物基因組是單倍體細(xì)胞中維持正常功能的最基本的一套染色體，包括全部的基因以及非編碼的序列。真核生物基因組包括了核基因組和細(xì)胞基因組。真核生物中，DNA與組蛋白結(jié)合形成的核小體是所有染色質(zhì)中的重復(fù)結(jié)構(gòu)單位。核小體結(jié)構(gòu)的主要特點：每個核小體包含約200bp的DNA和5種組蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4組蛋白是分子量較小的堿性蛋白質(zhì)，富含堿性氨基酸Lys，Ar。在生理條件下，組蛋白帶正電荷，與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，有利于DNA的穩(wěn)定。核小體中，組蛋白內(nèi)部核心由四種組蛋白H2A、H2B、H3、H4構(gòu)成致密的八聚體。DNA鏈在八聚體外部纏