DB51T 2468-2018 裂腹魚無乳鏈球菌病診斷技術規(guī)程　

1DB51DB51/T2468—2018裂腹魚無乳鏈球菌病診斷技術規(guī)程2018-04-18發(fā)布2018-05-01實施四川省質量技術監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 2 2 2 5 5 6 91裂腹魚（Schizothoraxwangchiachii）、長絲裂腹魚（SchizopygopsispylzoviKesskr）無乳鏈SC/T7201.1魚類細菌病檢疫技術規(guī)程指由無乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae）感染引起的齊口裂腹魚、重口裂腹魚、短須裂腹魚、BHIBrainHeartInfusion2cfb基因PCR擴增引物，P2-F：5’-AAGTACATGCTGATCAAGT-3’,P2-R：5’-TCTTGA3半固體瓊脂按GB/T4789.28中4.30的方法配制。把待檢菌穿刺接種于半固體瓊脂，28℃培養(yǎng)36h-48h。若待檢菌由穿刺線向四周擴散，其邊緣呈云霧狀，為運動性陽性；若待檢菌只生長在將待檢菌接種于DNA酶培養(yǎng)基平板（A.2）上，28℃培養(yǎng)48h。菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)粉紅色暈圈為陽將待檢菌接種于酯酶（Tween80）測定培養(yǎng)基平板（A.328℃培養(yǎng)7d在細菌生長的周圍有模糊按SC/T7014表2的乙酰甲基甲醇（V-P）試驗的規(guī)定執(zhí)行。培養(yǎng)基下層出現(xiàn)紅色為陽性，不出現(xiàn)4震蕩懸浮，加入50μl10％的SDS溶液（A.6加入100μL5mol/L的NaCl溶液（A.8充分混勻，再加入100μLCTAB/NaCl溶液（A.9）混勻，65℃溫育20min。加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25﹕24﹕1A.10混勻，12000r/min離心5min。取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24﹕1A.11混勻，12000r/min離心5min。取上清液，加入1倍體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜置10min，10000r/min離心10min；沉淀用70％酒精洗滌2次，室溫引物(20μmol/L)P1和P2各1.0μL混勻后，3000r/min離心30s。設空白對照，空白對照取等體PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性1min；48℃退火1min；72℃延伸1min；30次循環(huán)；72膠面。將上述6μL樣品和2μL溴酚藍指示劑溶液（A.13）混合后加入樣取上層水相轉入另一個離心管中，加入等體積的酚﹕氯仿﹕異戊醇（25﹕24﹕1A.10混勻，5-----++-- ++6試劑配方0.1g除DNA和甲苯胺藍之外的成分，加熱熔化后調pH至7.2.加入DNA和甲苯胺藍A.3酯酶（Tween80）試驗測冷卻基礎培養(yǎng)基至40℃-50℃,加Tween80至終濃度為1％，倒平板。7將0.121gTris堿（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二鈉（分子量372.24）加入80mL雙蒸水將29.22gNaCl（分子量58.444.1gNaCl溶解于80mL雙蒸水中，緩將25體積的酚、24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中，上面加上TE在400mL雙蒸水中溶解121gTris堿，加入28.55mL冰乙酸和50ml0.5/LEDTA。再加雙蒸水定容至8將溴酚藍100mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過夜。待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴91caactccacaagtggtaaatcatgtagcttgatcaagatagcattcagttgagatgaaaaaccggttaatgaggctattactccaaccctgagacagtttatgatttatgtgattgaagcaatcactttttcaactatattgatatgggatttgggataactaacagttgattcaattaaagctcaagtcttatcctgatttaaaaccaactgaaggaaatctggaatacacgcttt