《化妝品眼刺激性-雞胚絨毛尿囊膜血管試驗(yàn)》

ICS71.100.70

CCSY42

GDCA

廣東省化妝品學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GDCA010—2022

化妝品眼刺激性-雞胚絨毛尿囊膜血管試驗(yàn)

Cosmeticseyeirritation-ChorioallantoicMembraneVascularAssay

（征求意見稿）

在提交反饋意見時(shí)，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

廣東省化妝品學(xué)會(huì)??發(fā)布

T/GDCA010—2022

化妝品眼刺激性-雞胚絨毛尿囊膜血管試驗(yàn)

1范圍

本文件規(guī)定了雞胚絨毛尿囊膜血管試驗(yàn)的基本原理、試驗(yàn)準(zhǔn)備、試驗(yàn)方法、評判標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果分析。

本文件適用于化妝品、化妝品原料刺激性的評估。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T17999.1SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測第1部分：SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測總則

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

眼刺激性eyeirritation

眼前部直接接觸受試物后引起的眼及其周圍粘膜可逆性炎性變化。

絨毛尿囊膜chorioallantoicmembrane,CAM

胚齡4d～5d時(shí)，由絨毛膜體壁中胚層和尿囊膜臟層中胚層融合而成，其組織學(xué)結(jié)構(gòu)有三層。

鬼影血管ghostvessel

血管內(nèi)無血液灌注的血管現(xiàn)象。

充血hypermia

血管內(nèi)血液不流動(dòng)或血液充盈所致的血管膨脹現(xiàn)象。

出血Hemorrhage

血液從血管內(nèi)流出血管外，可以表現(xiàn)為血管外出現(xiàn)點(diǎn)狀出血或絮狀的彌漫性出血等多種形式。

無特定病原體SpecificpathogenFree,SPF

一般指無傳染病、無特定的微生物和寄生蟲存在。

4基本原理

絨毛尿囊膜（CAM）上豐富的血管網(wǎng)絡(luò)很好地模擬了眼結(jié)膜結(jié)構(gòu)，因此，基于CAM的體外測試是眼刺

激使用最早和最廣泛的替代方法之一。本試驗(yàn)利用孵化第10天胚齡受精雞胚絨毛尿囊膜血管系統(tǒng)完整、

明顯和透明的特點(diǎn)，將一定量受試物直接與絨毛尿囊膜接觸，作用一段時(shí)間之后觀察絨毛尿囊膜血管損

傷（如鬼影血管、毛細(xì)血管充血、不同程度的出血），對不同的血管損傷程度進(jìn)行評分，血管損傷越嚴(yán)

重分值越大，刺激性越嚴(yán)重。本試驗(yàn)特別強(qiáng)調(diào)CAM的血管效應(yīng)，如由此引發(fā)的鬼影血管、毛細(xì)血管充血、

不同程度的出血等現(xiàn)象。

5試驗(yàn)準(zhǔn)備

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雞胚

5.1.1品系和來源

應(yīng)當(dāng)選用SPF雞胚，推薦選用白萊杭雞（WhiteLeghornchicken）受精雞胚，也可選用其它品系雞

胚，供應(yīng)商應(yīng)具有農(nóng)業(yè)部門認(rèn)可的《獸藥生產(chǎn)、檢驗(yàn)用SPF雞(蛋)定點(diǎn)生產(chǎn)企業(yè)》資格，雞胚質(zhì)量應(yīng)符

合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求，如GB/T17999.1。

5.1.2運(yùn)輸和貯存

購買7天胚齡以內(nèi)的雞胚，應(yīng)在不影響胚胎活性或發(fā)育的情況下轉(zhuǎn)移或運(yùn)輸雞胚，盡量避免對雞胚

搖動(dòng)、不必要的傾斜、敲打以及其它機(jī)械性刺激。

未放置于孵化箱培養(yǎng)0天胚齡的雞胚宜置于13℃-22℃條件中存放，為減少貯存時(shí)間對種蛋質(zhì)量的影

響，一般不宜超過7天。

5.1.3孵化條件

孵化溫度37.5℃±0.5℃，相對濕度55%-70%，轉(zhuǎn)盤頻率1次/小時(shí)-6次/小時(shí)。0天胚齡的雞胚孵化前

應(yīng)使用含有濃度為0.1%苯扎溴銨溶液或其它不影響雞胚生長發(fā)育的消毒劑進(jìn)行清潔并消毒表面。

5.1.4試驗(yàn)雞胚挑選

試驗(yàn)前，將待檢測雞胚取出，置于黑暗處，用照蛋器檢查胚胎情況，若有豐富、規(guī)律的血管，則雞

胚存活，若血管稀少且無一定規(guī)律或無血管生長，則雞胚沒有孵化成活或沒有受精，棄之。

設(shè)備儀器和試劑

5.2.1試驗(yàn)所需儀器設(shè)備如下：

——恒溫恒濕培養(yǎng)箱；

——自動(dòng)孵化箱；

——LED高亮度冷光源照蛋器；

——解剖器具：醫(yī)用鋸齒鑷刀或尖頭鑷；

——聚四氟乙烯樹脂環(huán)：12*9*1.5mm；

——移液槍及一次性適配吸頭；

——電子計(jì)時(shí)器；

——玻璃器皿：錐形瓶、小燒杯；

——保鮮膜；

——小噴壺。

5.2.2試驗(yàn)所需試劑如下：

本文件所用試劑和水，除非另有規(guī)定，應(yīng)使用分析純試劑和應(yīng)符合GB/T6682-三級(jí)水的規(guī)定。

——氯化鈉；

——丙烯酰胺；

——無菌水。

受試物及制備

5.3.1原料

應(yīng)根據(jù)常用添加量或建議添加量選一個(gè)或多個(gè)濃度用溶劑制備成澄清的溶液。水溶性原料可采用無

菌水作為溶劑，油溶性原料可采用橄欖油或其它不引起血管損傷的物質(zhì)作為溶劑。

5.3.2化妝品成品或半成品

化妝品半成品及成品應(yīng)以原液未稀釋的形式進(jìn)行測試；面膜成品應(yīng)將料體擠至無菌的錐形瓶中再進(jìn)

行測試。

對照物及制備

5.4.1陰性對照

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通常選用質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉溶液，用于陰性對照。每次受試物測試，均應(yīng)設(shè)置0.9％氯化鈉

溶液的陰性對照，確保試驗(yàn)條件不會(huì)導(dǎo)致刺激性反應(yīng)出現(xiàn)。

5.4.2陽性對照

每次試驗(yàn)都應(yīng)設(shè)立一個(gè)陽性對照，如果檢測試驗(yàn)只是用于鑒定嚴(yán)重刺激性物質(zhì)，則陽性對照物應(yīng)當(dāng)

是一種在CAMVA中能產(chǎn)生嚴(yán)重反應(yīng)的物質(zhì)，如10%丙烯酰胺。一般來說，10%丙烯酰胺通常表現(xiàn)為中度刺

激性。亦可選用其他具有中度刺激性物質(zhì)作為陽性對照。

5.4.3溶劑對照

如果受試物用橄欖油進(jìn)行稀釋，那么試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置橄欖油為溶劑對照。如果使用除無菌水或橄欖油以

外的其他溶劑或載體，則選擇這種溶劑或載體作為對照物質(zhì)。

預(yù)試驗(yàn)

5.5.1預(yù)試驗(yàn)?zāi)康募氨匾?/p>

確定受試物是否適合用本方法試驗(yàn)，確定受試物的血管情況是否能夠用該評價(jià)方法進(jìn)行評價(jià)。（可

參考表1）。

5.5.2預(yù)試驗(yàn)條件

需要對受試樣品進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，一般針對顏色較為特殊或可能具有染色功能的原料、半成品及成品或

受試樣品的狀態(tài)為粉狀等特殊樣品需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。

5.5.3預(yù)試驗(yàn)過程

預(yù)試驗(yàn)用3枚雞胚，取約40μL（μg）受試物均勻覆蓋在受試環(huán)內(nèi)的CAM表面，受試物作用30分鐘后，

觀察血管反應(yīng)情況，記錄觀察結(jié)果。

5.5.4受試物局限性

如果預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明血管損傷情況不屬于標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)（見表1）范圍內(nèi)及受試物的物理特性，既不能

用液體添加法（見6.3）也不能用固體添加法（見6.4）進(jìn)行試驗(yàn)，則正式試驗(yàn)不必進(jìn)行。

這些情況包括：

——血管效應(yīng)不屬于標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)范圍；

——對血管具有藥理作用的血管活性物質(zhì)；

——對CAM具有不可逆染色作用的染料；

——對CAM具有粘附作用且不可沖冼的粘性物質(zhì)。

6試驗(yàn)方法

試驗(yàn)分組

每個(gè)受試樣品應(yīng)采用10枚雞胚進(jìn)行測試，每批次雞胚應(yīng)設(shè)陰性對照、陽性對照，各不小于3枚，必

要時(shí)應(yīng)設(shè)立溶劑對照。

CAM制備

取出一個(gè)10天胚齡的雞胚，用照蛋器照看氣室，確定氣室位置，用手捻鉆手動(dòng)打孔工具在氣室上開

一個(gè)小窗口，用醫(yī)用眼科彎尖頭鑷子剝?nèi)馐疑蠈拥牡皻げ糠?，暴露白色的卵殼膜，吸管滴加適量0.9%

氯化鈉溶液使卵殼膜濕潤，待完全濕潤后將0.9%氯化鈉溶液傾出。小心用鑷子去除卵殼膜，去除過程中

要謹(jǐn)慎，保證血管膜不受損，去除卵殼膜后露出豐富毛細(xì)血管的則是CAM。

液體添加法

6.3.1添加受試樣

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將聚四氟乙烯樹脂環(huán)置于CAM上，作為受試區(qū)域，用移液槍移取40μL的待測樣品至聚四氟乙烯樹脂

環(huán)內(nèi)，記錄加樣品的時(shí)間,用無菌水打濕保鮮膜后并將打濕面的保鮮膜蓋在氣室上，把雞胚移至恒溫恒

濕箱內(nèi)培養(yǎng)30分鐘。

6.3.2結(jié)果觀察

取出受試雞胚，根據(jù)血管損傷程度評分（標(biāo)準(zhǔn)可參考表1）。必要時(shí)可設(shè)備對反應(yīng)前后的絨毛尿囊

膜情況進(jìn)行拍照記錄，并通過過反應(yīng)前后的照片比對，對CAM的損傷情況及程度進(jìn)行分析。

固體添加法

6.4.1添加受試物

將聚四氟乙烯樹脂環(huán)置于雞胚的絨毛尿囊膜上，作為受試區(qū)域，用藥勺或活塞式移液器取適量的待

測樣品約40μg，即均勻鋪平至聚四氟乙烯樹脂環(huán)內(nèi)。記錄加樣時(shí)間用無菌水打濕保鮮膜后并將打濕面的

保鮮膜蓋在氣室上，把雞胚移至恒溫恒濕箱內(nèi)培養(yǎng)30分鐘。

6.4.2結(jié)果觀察

取出受試雞胚，根據(jù)血管損傷程度評分。若受試物影響結(jié)果的觀察，則在觀察前需用0.9%生理鹽水

輕輕沖洗受試區(qū)域內(nèi)待測物質(zhì)，直至可清晰觀察到CAM的情況為止，沖洗次數(shù)盡可能保持在3次以內(nèi)。取

出雞胚后應(yīng)立即觀察環(huán)內(nèi)的血管損傷情況并進(jìn)行評分（標(biāo)準(zhǔn)可參考表1）。必要時(shí)可用設(shè)備對反應(yīng)前后

的CAM情況進(jìn)行拍照記錄，并通過反應(yīng)前后的照片比對，對CAM的損傷情況及程度進(jìn)行分析及評價(jià)。

表1評分標(biāo)準(zhǔn)

血管效應(yīng)評分現(xiàn)象描述

無反應(yīng)0觀察不到反應(yīng)，CAM正常。

鬼影血管1血管內(nèi)無血流，血管清晰。

毛細(xì)血管損傷2充血，即CAM毛細(xì)血管或小血管的管血流增加。

極輕微出血3環(huán)內(nèi)有細(xì)小出血點(diǎn)（1-10個(gè)）。

輕微出血4環(huán)內(nèi)有細(xì)小出血點(diǎn)＞10個(gè)或小出血點(diǎn)不可數(shù)且覆蓋環(huán)內(nèi)區(qū)域不足1/8。

極輕度出血5環(huán)內(nèi)出血點(diǎn)覆蓋面積1/8－1/4。

輕度出血6環(huán)內(nèi)出血點(diǎn)覆蓋面積1/4－1/2。

中度出血7環(huán)內(nèi)大量出血點(diǎn)或小區(qū)域出血范圍達(dá)到1/2－3/4。

嚴(yán)重出血8環(huán)內(nèi)出血點(diǎn)區(qū)域＞3/4。

7結(jié)果分析

每枚雞蛋的結(jié)果應(yīng)進(jìn)行評價(jià)及記分，最終將得出的10個(gè)分值去除最高分和最低分，剩余8個(gè)有效分

值，根據(jù)應(yīng)用式（1）計(jì)算刺激分（Normalconcentrationirritationscore，NC）。

····················································(1)

?1+?2+…+??

式中：??=?

X——刺激評分；

n——去除最高分和最低分后有效雞胚個(gè)數(shù)。

根據(jù)計(jì)算的NC數(shù)值按表2受試物刺激性進(jìn)行分類。

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表2刺激性評價(jià)

分值表現(xiàn)備注

0<NC≦2無刺激無損傷性刺激，此時(shí)毛細(xì)血管未有出血損傷。

2<NC≦3輕微刺激輕微損傷性刺激，此時(shí)毛細(xì)血管出現(xiàn)輕微性出血損傷。

3<NC≦5中度刺激較為嚴(yán)重的損傷性刺激，此時(shí)毛細(xì)血管出現(xiàn)較為嚴(yán)重的出血損傷。

NC＞5嚴(yán)重刺激極為嚴(yán)重的損傷性刺激，此時(shí)毛細(xì)血管大面積出血，且出血量較大。

8廢棄物處置

試驗(yàn)用雞胚應(yīng)用高濃度消毒劑消毒處置后，按一般的廢棄物進(jìn)行處理。具有刺激性、丙烯酰胺等廢

液按危險(xiǎn)廢物處理。

9檢測結(jié)果報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包含以下內(nèi)容：

——受試物信息：名稱、批次、樣品性狀及特性；

——受試物測試雞胚個(gè)數(shù)、有效雞胚個(gè)數(shù)、分值及結(jié)果評價(jià)。

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A

A

附錄A

（資料性）

測試結(jié)果中血管效應(yīng)

測試結(jié)果中血管效應(yīng)代表性圖見表A.1。

表A.1測試結(jié)果中血管效應(yīng)代表性圖

無反應(yīng)鬼影血管

毛細(xì)血管損傷極輕微出血

輕微出血極輕度出血

輕度出血中度出血

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嚴(yán)重出血