《長(zhǎng)三角地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素抗性菌株的產(chǎn)生及污染問題研究》7800字（論文）

第頁共10頁長(zhǎng)三角地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素抗性菌株的產(chǎn)生及污染問題研究1引言 22水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素抗性菌株的產(chǎn)生及污染 22.1抗性菌株的產(chǎn)生 22.2抗性基因的污染來源 33水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗性基因的傳播擴(kuò)散及方法 43.1抗性基因的傳播擴(kuò)散 43.2抗性基因的檢測(cè)方法 64開展此研究的必要性 7結(jié)論 8參考文獻(xiàn) 9摘要：我國(guó)是世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，約占世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%.但近年來由于水產(chǎn)養(yǎng)殖污染加劇，造成養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量不斷惡化,導(dǎo)致病原生物種類增多和傳播速度加快，養(yǎng)殖病害日趨嚴(yán)重，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病害問題特別是細(xì)菌性病害在密集型養(yǎng)殖系統(tǒng)中發(fā)生頻繁且影響嚴(yán)重，這極大地限制了我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，目前病害防治的主要方法是使用抗生素類藥物。本文選取著名的水產(chǎn)養(yǎng)殖地——長(zhǎng)三角作為研究對(duì)象，分析抗生素造成污染的原因。關(guān)鍵詞：抗生素；抗性菌株；長(zhǎng)三角地區(qū)1引言抗生素除了防治疾病之外，還有促進(jìn)生長(zhǎng)以及節(jié)約營(yíng)養(yǎng)成分等方面的作用.目前抗生素作為飼料添加劑在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中使用非常普遍.抗生素的長(zhǎng)期濫用很可能會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗生素抗性基因(Antibioticsresistancegenes,ARGs),ARGs經(jīng)排泄后將對(duì)養(yǎng)殖區(qū)域及其周邊環(huán)境造成潛在基因污染.目前在不同的環(huán)境介質(zhì)如水體、沉積物、水生生物和細(xì)菌體內(nèi)等均已檢出ARGs的存在，并且有研究還發(fā)現(xiàn)ARGs能夠通過可移動(dòng)的遺傳元件(Geneticmobileelements)在細(xì)菌之間傳播，進(jìn)而在環(huán)境中擴(kuò)散，這將會(huì)對(duì)公共健康和食品安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅.針對(duì)以上問題，本文對(duì)抗生素抗性基因在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的來源、污染現(xiàn)狀、潛在的傳播途徑及其機(jī)制和相關(guān)的檢測(cè)方法進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，并指出了當(dāng)前形勢(shì)下我國(guó)開展水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素抗性基因研究的必要性和重要性，建議政府和有關(guān)機(jī)構(gòu)盡快開展水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素抗性基因的污染機(jī)理與控制對(duì)策研究。2水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素抗性菌株的產(chǎn)生及污染2.1抗性菌株的產(chǎn)生目前，由于缺乏科學(xué)的管理和相應(yīng)制度上的制約，一些養(yǎng)殖業(yè)主盲目追求產(chǎn)量，長(zhǎng)期在飼料中添加抗生素以促進(jìn)生長(zhǎng)，因此近年來抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的濫用現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，直接后果是在水產(chǎn)環(huán)境和養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)出抗性菌株.Kerry等(1996)從美國(guó)東南部的水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中.分離出了革蘭氏陰性菌(主要是類志賀鄰單胞菌和嗜水氣單胞菌)，發(fā)現(xiàn)與未使用抗生素的河流相比，使用過抗生素的池塘中抗四環(huán)素、氯霉素、氨比西林和呋喃妥英的抗性細(xì)菌的數(shù)量明顯增多.其他相關(guān)研究也證明在使用過抗生素后，抗性菌株普遍存在1990年前英國(guó)在漁業(yè)生產(chǎn)上從未使用過阿莫西林，因此在這以前從水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)分離的殺鮭氣單胞菌均對(duì)阿莫西林敏感;幾年之后阿莫西林開始用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，結(jié)果在一次癤病爆發(fā)中分離出了抗阿莫西林的菌株。隨著各種抗生素的過度使用，細(xì)菌對(duì)抗生素的抗藥性已由單一抗藥逐漸發(fā)展為多重抗藥，目前的研究也發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗性菌株的表現(xiàn)型為多重抗藥性.多重抗藥就是(MultipleDrugResistance,MDR)系指一種微生物同時(shí)對(duì)多種常用的抗生素類藥物產(chǎn)生抗藥性(張偉等，2008).細(xì)菌多重抗藥性的產(chǎn)生與環(huán)境中的抗生素多重選擇的壓力密切相關(guān).Novick(1981)指出在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中使用亞治療劑量的抗生素也會(huì)促進(jìn)產(chǎn)生多重抗藥性菌株.已有很多研究報(bào)道在水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的動(dòng)物體內(nèi)和環(huán)境中發(fā)現(xiàn)多重抗藥菌株的存在.Tendencia和DeLaPena(2001)在菲律賓的一個(gè)養(yǎng)蝦池塘中發(fā)現(xiàn)與未使用過抗生素的池塘比較，使用過惡喹酸的蝦塘里抗多重藥物(至少兩種)的弧菌很常見.Schmidt等(2000)從虹鱒魚養(yǎng)殖場(chǎng)分離出的氣單胞菌株除了抗四環(huán)素外，大部分也抗磺胺嘧啶或甲氧芐氨嘧啶;Jun等(2004)從韓國(guó)患流行病的養(yǎng)殖魚(包括比目魚和鰻魚)體內(nèi)分離得到127個(gè)臨床菌株，其中有20個(gè)抗四環(huán)素的愛德華遲鈍菌株，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)20個(gè)菌株都具有多重抗藥性，除了抗四環(huán)素外，這些菌株對(duì)惡喹酸、萘啶酸、氯霉素、氨比西林、卡那霉素和鏈霉素等抗生素也有抗性;Penders和Stobberingh(2008)在荷蘭南部的室內(nèi)鯰魚和鰻魚飼養(yǎng)場(chǎng)利用能動(dòng)氣單胞菌作為指示細(xì)菌測(cè)定出氨比西林和土霉素的抗藥率是100%，磺胺甲惡唑是24%，甲氧芐氨嘧啶是3%，環(huán)丙沙星和氯霉素分別是10%.由此可見在使用過抗生素的環(huán)境中普遍存在著多重抗藥性菌株。細(xì)菌多重耐藥性的產(chǎn)生除了與環(huán)境中多種抗生素同時(shí)存在產(chǎn)生的選擇壓力有關(guān)外，主要原因是多重抗藥性基因可以在環(huán)境中微生物之間進(jìn)行連鎖傳播，推測(cè)其機(jī)制與質(zhì)粒(Plasmind)等可移動(dòng)的遺傳元件有關(guān)(Sunetal,2009).質(zhì)粒大都攜帶某種抗性基因，并且不同大小的質(zhì)粒含有的抗性基因不同.Udo和Grubb(1991)報(bào)道4.4kb質(zhì)粒與鏈霉素耐藥有關(guān)，23.8kb質(zhì)?？赡軘y帶多種抗菌藥的抗性基因.Akinbowale等(2006)在86個(gè)至少對(duì)一種抗生素有抗性的菌株中發(fā)現(xiàn)74.4%的含有質(zhì)粒，數(shù)量在1~10個(gè)之間，大小為2~51kbp.此外質(zhì)粒還可以作為轉(zhuǎn)座子(Transposon)及整合子(Integron)/基因盒(Genecassette)的載體，使得質(zhì)粒DNA上的抗性基因通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合等方式在同種屬甚至不同種屬細(xì)菌的質(zhì)粒與質(zhì)粒間、質(zhì)粒與染色體間不斷轉(zhuǎn)移，并通過特異性的整合和重組使多種耐藥基因聚集到細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒上，致使細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性在抗生素選擇壓力下，質(zhì)粒和與之相關(guān)的轉(zhuǎn)座子使耐藥性的轉(zhuǎn)移和傳播更加迅速，水平獲得耐藥基因的亞群可發(fā)展成優(yōu)勢(shì)菌群并將其垂直遺傳給子代(李曉云等，2008).此外，整合子作為繼質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子之后人類發(fā)現(xiàn)的又一重要的細(xì)菌多重耐藥及水平傳播機(jī)制，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它的存在和多重抗性的表現(xiàn)型之間有較大的關(guān)聯(lián)(Leverstein-vanHalletal.,2002)2.2抗性基因的污染來源抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的濫用不僅會(huì)引起水生動(dòng)物體內(nèi)的抗生素殘留，而且在使用過程中未被水生生物吸收的抗生素、以及隨水生生物糞便排泄的抗生素和穿過網(wǎng)箱未被生物食用的飼料中的抗生素最終溶入海水或隨懸浮物沉降匯集于底部沉積物。殘留在生物體內(nèi)和進(jìn)入環(huán)境中的抗生素會(huì)在養(yǎng)殖生物的腸道細(xì)菌內(nèi)和環(huán)境細(xì)菌內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生攜帶抗性基因的抗藥菌株，經(jīng)過質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移等機(jī)制將ARGs傳播給其它的細(xì)菌，造成抗性基因在水生環(huán)境中的擴(kuò)散,這是抗性基因的一種污染來源。為了實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，更加合理地開發(fā)利用養(yǎng)殖資源，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)正在由傳統(tǒng)的粗放型養(yǎng)殖場(chǎng)向集約式方向邁進(jìn)，而集約式養(yǎng)殖場(chǎng)較傳統(tǒng)養(yǎng)殖場(chǎng)更容易誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性細(xì)菌.集約式養(yǎng)殖場(chǎng)通常使用的是食用過抗生素飼料的陸地動(dòng)物的糞便，而糞便中可能含有殘留的抗生素和抗性菌株，因此采自此類養(yǎng)殖場(chǎng)底泥中的細(xì)菌和魚腸道內(nèi)的細(xì)菌抗性水平可能會(huì)比傳統(tǒng)養(yǎng)殖場(chǎng)的要高(Petersenetal,2002;PetersenandDalsgaard,2003a;2003b).這一方面由糞便中殘留的抗生素所產(chǎn)生的選擇壓力所致，另一方面，可能是糞便中含有攜帶抗性基因的腸球菌將轉(zhuǎn)座子(包括接合轉(zhuǎn)座子)、抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到受體細(xì)菌所致.這些細(xì)菌進(jìn)入魚塘后，通過水平遷移等機(jī)制將抗性基因轉(zhuǎn)移到水產(chǎn)環(huán)境和水產(chǎn)動(dòng)物的腸道細(xì)菌體內(nèi)而獲得抗性.Petersen等人(2002)研究了集約式漁牧混養(yǎng)場(chǎng)對(duì)細(xì)菌抗藥率的影響，發(fā)現(xiàn)從水底泥的混合樣品中分離的指示菌不動(dòng)細(xì)菌屬對(duì)6種不同的抗生素的抗藥率與實(shí)驗(yàn)之前相比有很大的提高，實(shí)驗(yàn)之前的抗藥率是1~5%，兩個(gè)月后對(duì)土霉素和磺胺甲惡唑的抗藥率達(dá)到100%，對(duì)丙氟哌酸的抗藥率大于80%。目前，除了水產(chǎn)養(yǎng)殖外，畜牧養(yǎng)殖業(yè)也廣泛使用抗生素，禽畜動(dòng)物腸道內(nèi)被誘導(dǎo)出攜帶抗性基因的抗性菌株，這些抗性菌株最終通過地表徑流和糞便的滲濾進(jìn)入地下水、河流地表水和近岸海水中，由于水產(chǎn)養(yǎng)殖大多以河流地表水為供水水源，因此，河流中的抗性菌株進(jìn)入水產(chǎn)環(huán)境內(nèi)，通過細(xì)菌間的質(zhì)粒交換，抗性基因進(jìn)入水產(chǎn)動(dòng)物的致病菌體內(nèi)，造成潛在的抗性基因污染.圖1ARGs種類3水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗性基因的傳播擴(kuò)散及方法3.1抗性基因的傳播擴(kuò)散目前所知的細(xì)菌抗藥的基因機(jī)制有兩個(gè)途徑:1)自身基因突變.該類抗藥性來源于細(xì)菌固有的(自然發(fā)生)特征，即本身就有抗藥基因存在于其染色體上，也叫染色體介導(dǎo)的抗藥性，在自然界的耐藥菌中占次要地位;2)抗藥基因的獲得.細(xì)菌主要通過4種方式獲得，即轉(zhuǎn)化(Transformation)、轉(zhuǎn)導(dǎo)(Transduction)、接合(Conjugation)和轉(zhuǎn)座(Transposion).細(xì)菌的抗藥性多為外在環(huán)境誘導(dǎo)下經(jīng)可動(dòng)遺傳因子，如質(zhì)粒(Plasmid)、轉(zhuǎn)座子(Transposon)、噬菌體(Bacteriophage)、整合子(Integron)/基因盒(Genecassette)等的傳遞而獲得.這種方式獲得抗藥性機(jī)率高，形成后較穩(wěn)定，是引起抗藥性散播的主要原因(曹文斌等，2005)Akinbowale等(2006)在澳大利亞的水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)分離的86個(gè)抗性菌株中發(fā)現(xiàn)74.4%的菌株含有不同數(shù)量和大小的質(zhì)粒.這表明細(xì)菌表現(xiàn)為抗藥性很可能是因?yàn)橛行┘?xì)菌體內(nèi)攜帶抗性基因，而這些抗性基因則位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，如sul2基因通常位于質(zhì)粒上，并且具有廣泛的宿主性(Scholzetal.1989;Smallaetal,2000);tet(M)通常和接合性轉(zhuǎn)座子Tn1545-Tn916相結(jié)合，Tn1545-Tn916是一個(gè)廣宿主的轉(zhuǎn)座子，它可以在52個(gè)種24個(gè)屬的細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移(ChopraandRoberts,2001;Clewelletal.,1995;Salyersetal.,1995)），這使得抗性基因可以通過染色體垂直傳播或者質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子水平傳播而在環(huán)境中廣泛傳播造成污染.由于抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中長(zhǎng)期的濫用,在養(yǎng)殖動(dòng)物腸道內(nèi)誘導(dǎo)出抗性菌株，這些編碼抗生素抗性基因的菌株是水產(chǎn)環(huán)境中抗生素抗性基因最重要的來源.-旦微生物具有了這種抗性基因，它們能通過例如質(zhì)粒交換來水平轉(zhuǎn)移基因從而傳播抗性基因.有些生物腸道菌中的抗性基因位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可動(dòng)遺傳因子(MobileGeneticElement).上，能夠通過基因交換水平擴(kuò)散到底泥和海水中的其它種的細(xì)菌中(羅義和周啟星，2008).例如sul基因可以通過整合子和轉(zhuǎn)座子或是利用噬菌體和移動(dòng)質(zhì)粒作為它們傳播的工具(SmallaandSobecky,2002).許多研究表明某些tet基因也可以被接合性質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子攜帶而在環(huán)境中進(jìn)行傳播(Junetal.,2004;Agers覬etal.,2007;ChopraandRoberts,2001;Clewelletal.,1995;Salyersetal.,1995).不僅同菌屬.間可以進(jìn)行質(zhì)粒的交換，研究還發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的交換也可以發(fā)生在不同菌屬.Rhodes等(2000)發(fā)現(xiàn)編碼四環(huán)素抗性基因的相關(guān)質(zhì)?？梢栽诓煌臍鈫伟鷮俸痛竽c埃希氏菌中傳播.Twiddy和Reilly(1995)在東南亞的一個(gè)常使用抗生素的魚塘中發(fā)現(xiàn)對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性的沙門氏菌、嗜水氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌，并發(fā)現(xiàn)編碼抗性的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子會(huì)從一種菌傳播到另一種.菌，最終會(huì)將抗性質(zhì)粒傳播到在水產(chǎn)環(huán)境中不常見的致病菌體內(nèi).Akinbowale等(2006)從澳大利亞的水產(chǎn)地區(qū)分離的12個(gè)抗土霉素菌株中，有5個(gè)菌株可以將它們的R質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到來自雞、豬和人類的大腸桿菌受體中，而且tet(A)、tet(D)和tet(M)可以轉(zhuǎn)移，tet(E)不可以，這可能是因?yàn)閠et(E)基因通常是與非接合性質(zhì)粒連接在一起的，此外在海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖中，海水中的細(xì)菌也有可能將抗性基因轉(zhuǎn)移到魚腸道的細(xì)菌里(Nonakaetal.,2000)，也有報(bào)道當(dāng)處于無抗性壓力的條件下時(shí)，海洋細(xì)菌會(huì)在幾代之后丟失質(zhì)粒DNA(Chadnrasekaranetal.,1998).整合子是近年來在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的天然克隆表達(dá)系統(tǒng)，它是一種基因片段，具有位點(diǎn)特異性重組功能，能識(shí)別、俘獲及表達(dá)外來移動(dòng)性基因盒，使得抗藥基因在環(huán)境中發(fā)生擴(kuò)散(劉婷婷和李鳳云，2006).當(dāng)整合子不能移動(dòng)時(shí)，它便趨向于與轉(zhuǎn)座子或是接合性質(zhì)粒相連接，作為它們傳播的工具(Ployetal,2000).已有研究表明氣單胞菌屬攜帶整合子，而整合子可以獲得或丟失抗生素抗性基因(FluitandSchmitz,1999)有些地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)某種抗生素雖然已經(jīng)被禁止使用很長(zhǎng)時(shí)間，但仍可以在環(huán)境中追蹤檢測(cè)到此類抗生素的抗性細(xì)菌存在.Dang等(2006a)在中國(guó)北方的一個(gè)海參和海膽的養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)，從海參中分離的抗氯霉素菌株中，有65%的菌株含有catIV或catlI基因，而從海膽中分離的抗氯霉素菌株中，35%的含有catlI基因，而且所有對(duì)cat呈陽性的菌株還攜帶一個(gè)或兩個(gè)tet(B)、tet(D)或tet(A).此外Dang等(2006b)在對(duì)中國(guó)一個(gè)海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，分離出的多重抗藥菌株中cat基因與tet(B)基因的出現(xiàn)有很好的相.關(guān)性.而早在1999年氯霉素在中國(guó)就已經(jīng)被禁止用于海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有兩個(gè)，一方面可能是因?yàn)榉侥峥嫉氖褂?，它是氯霉素的一種衍生物，另一方面可能是由于土霉素的交叉選擇而導(dǎo)致產(chǎn)生交叉抗藥性(CrossDrugResistance).交叉抗藥性是指某種病原菌對(duì)一種藥物產(chǎn)生耐藥性后，往往對(duì)同一類的藥物也具有耐藥性的現(xiàn)象，產(chǎn)生這-現(xiàn)象的原因是因?yàn)橥惖乃幬锿哂邢嗤淖饔冒形?，而不同種類的藥物結(jié)構(gòu)不同，作用靶位也不同(CourvalinandTrieu-Cuot,2001).因此cat基因的出現(xiàn)極有可能是土霉素共同選擇的結(jié)果，Courvalin和Trieu-Cuot(2001)推測(cè)其基因機(jī)制可能是tet基因與cat基因位于同一個(gè)可移動(dòng)遺傳因子，比如質(zhì)粒、轉(zhuǎn).座子或整合子，這種推斷尚需要進(jìn)一步的研究證實(shí).研究表明環(huán)境中攜帶抗性基因的細(xì)菌可以將抗性基因轉(zhuǎn)移到人體致病菌中.例如腸球菌可以轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)座子(包括接合性轉(zhuǎn)座子)、抗性質(zhì)粒到很多受體菌體內(nèi)(Morrisonetal.,1997)，所以它們可能會(huì)成為革蘭氏陽性菌(包括人類致病菌)的抗性基因庫.Furushita等(2003)在日本3個(gè)不同的漁場(chǎng)采集的魚中檢測(cè)出抗四環(huán)素菌株，結(jié)果顯示魚的菌株中攜帶的抗四環(huán)素基因的序列和從人類臨床分離的菌株中存在的抗四環(huán)素基因的序列呈現(xiàn)出高度的相似性.Rhodes等(2000)研究發(fā)現(xiàn)土霉素抗性質(zhì)粒在水產(chǎn)和醫(yī)院分離的菌株之間發(fā)生了轉(zhuǎn)移，這為抗性質(zhì)粒在氣單胞菌和大腸桿菌中轉(zhuǎn)移提供了直接的證據(jù).這些資料充分說明水產(chǎn)環(huán)境中的抗性菌可能會(huì)將抗性基因傳播到人體內(nèi)病原菌，使人致病菌攜帶抗性.另有研究表明，攜帶ARGs的微生物菌株死亡后，攜帶ARGs的DNA可釋放到環(huán)境中并持久存在(Blumetal.,1997;HillandTop,1998;Crecchioetal.,2005)，原因是在脫氧核糖核酸酶(DNase)的保護(hù)下，防止其被降解.依此推斷，水生環(huán)境中裸露的DNA分子最終可能會(huì)轉(zhuǎn)入到其他生物體細(xì)胞內(nèi)，造成抗性基因在水生環(huán)境中的傳播和擴(kuò)散，并可能通過直接接觸或污染食物鏈等多種途徑進(jìn)入人體，增加人體的抗生素抗藥性，使細(xì)菌感染性疾病的治療更加棘手.抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的大量使用,使水和土壤環(huán)境不僅成為抗性基因的儲(chǔ)庫，也成為抗性基因擴(kuò)展和演化的媒介.圖2抗生素抗生基因種類3.2抗性基因的檢測(cè)方法抗性基因作為-種新型的污染物已經(jīng)在不同的環(huán)境體系如河流底泥、海水、灌溉渠、污水處理場(chǎng)的出水、農(nóng)場(chǎng)的瀉湖等被檢測(cè)出(Prudenetal.,2006;Aminovetal.,2001;2002;Smithetal,2004;Peietal.,2006;Kimetal.,2004;Henriquesetal.,2006)，最終可能會(huì)通過食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)，對(duì)食品安全和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅，因此建立環(huán)境中抗性基因的檢測(cè)方法就顯得尤為重要.目前的抗性基因檢測(cè)方法主要有兩種，傳統(tǒng)的方法是利用抗性平板法篩選出抗性細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行總量的測(cè)定，并鑒定出抗性細(xì)菌的種屬，然后從菌體中提取DNA,再用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)環(huán)境中的抗性基因.由于環(huán)境中許多微生物難以平板培養(yǎng)，主要是因?yàn)閷?duì)其最適生長(zhǎng)溫度、pH、氧、營(yíng)養(yǎng)成分等不十分清楚.因此，以傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的方法評(píng)價(jià)抗性難免低估了微生物的種類.因此，發(fā)展了直接在環(huán)境樣品中提取總DNA，再利用PCR方法分析環(huán)境中的抗性基因的方法.該方法與細(xì)胞抽提法相比較，優(yōu)點(diǎn)是提取DNA率高，簡(jiǎn)便快捷(陳竹等，2007)，但從環(huán)境樣品中直接提取的DNA樣品難免會(huì)殘存腐殖酸和一些酚類物質(zhì)，對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如PCR、限制性內(nèi)切酶等反應(yīng)有一些影響，因此在提取的過程中需要對(duì)其進(jìn)行純化處理.細(xì)菌的總量測(cè)定一般采用最大可能數(shù)法(MPN)，這是一種應(yīng)用概率理論來估算細(xì)菌濃度的方法.種屬鑒定包括傳統(tǒng)的生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定方法.其中16SrDNA和BIOLOG就是較為常見的分子生物學(xué)鑒定技術(shù).近年來，在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展了Realtime-PCR(RTQ-PCR)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍.該技術(shù)的基本原理是在反應(yīng)體系中加入熒光探針，運(yùn)用Taq酶的5'-3'外切酶活性和熒光能量傳遞技術(shù)，巧妙地把核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合在一起，借助熒光信號(hào)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知核酸模板進(jìn)行定量分析的方法.Realtime-PCR技術(shù)的發(fā)展和完善，為環(huán)境中存在的抗生素抗性基因的研究提供了方法學(xué).上極大的可能.除了上述常見的方法以外，有的研究(PhuongHoaetal.,2008;Mirandaetal,2003)也利用Southern印記雜交法龍ok(SouthernBlotting)和DNA-DNA雜交法(DNA-DNAHybridization)進(jìn)行抗性基因的定性和定量.4開展此研究的必要性隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來越廣泛，水產(chǎn)業(yè)的病害問題是制約其發(fā)展的一個(gè)重要因素，目前在世界范圍內(nèi)通用的防治措施是使用抗生素.目前歐美已經(jīng)通過許可監(jiān)督程序?qū)λa(chǎn)品中的抗生素藥殘進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制，從而達(dá)到對(duì)抗生素使用的有效監(jiān)管，我國(guó)作為水產(chǎn)業(yè)大國(guó)，水產(chǎn)養(yǎng)殖的年產(chǎn)出量不斷增長(zhǎng)決定了抗生素的使用不會(huì)迅速退出歷史舞臺(tái)，但我國(guó)尚未制訂嚴(yán)格的監(jiān)管措施，盡管有些藥品(如氯霉素)屬禁用藥品，但在部分地區(qū)并未真正做到令行禁止，直接導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素使用管理混亂，因此在我國(guó)由抗生素誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗性基因?qū)Νh(huán)境造成的污染可能比世界其它各國(guó)更為嚴(yán)重，加之藥品生產(chǎn)和使用監(jiān)管力度不足，抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中濫用的情況十分嚴(yán)重，直接后果即導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)抗性菌株的產(chǎn)生，并極有可能在環(huán)境中進(jìn)行傳播和擴(kuò)散，對(duì)人體健康構(gòu)成潛在威脅(Hunteretal.,1994;朱力軍，2001).已有證據(jù)表明，畜牧活動(dòng)能導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)的抗性菌株擴(kuò)散進(jìn)入環(huán)境并將其攜帶的抗性基因傳播給環(huán)境微生物(Chee-Sanford,2001;lsaacsonandTorrence,2002;Furushitaetal.,2003).一旦獲得了抗藥性，這些環(huán)境微生物可通過多種方式傳播進(jìn)入人體，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在的威脅，而且我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖點(diǎn)多位于沿海灘涂，這使得抗性菌株和抗性基因更容易擴(kuò)散進(jìn)入公海水域，不但會(huì)對(duì)整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)造成威脅，甚至對(duì)相鄰國(guó)家的水域也會(huì)造成抗性基因的污染，這將直接有損我國(guó)在國(guó)際上進(jìn)出口貿(mào)易的國(guó)際形象和經(jīng)濟(jì)收益(羅義和周啟星，2008).抗生素作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的抗細(xì)菌性疾病藥物，在現(xiàn)階段仍具有不可替代的作用.因此，針對(duì)我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素這一現(xiàn)狀，開展?jié)O業(yè)環(huán)境抗生素抗性基因污染的研究，揭示抗生素抗性基因在漁業(yè)環(huán)境中的擴(kuò)散和傳播規(guī)律，對(duì)于評(píng)價(jià)抗生素抗性基因的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)十分必要，不僅能確保我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，而且對(duì)于我國(guó)的生態(tài)安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義目。結(jié)論目前，在我國(guó)對(duì)于抗生素抗性基因在環(huán)境中的來源、傳播和擴(kuò)散機(jī)制等研究數(shù)據(jù)還尚處于空白，水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗性基因的污染尚未引起人們的足夠重視，我國(guó)又是一個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，在抗生素的使用種類和數(shù)量方面還沒有相應(yīng)規(guī)章制度的約束，而且有些漁民缺乏這方面的知識(shí)，造成抗生素的濫用現(xiàn)象十分嚴(yán)重，直接導(dǎo)致環(huán)境中抗性基因的產(chǎn)生和傳播擴(kuò)散，所以呼吁政府和有關(guān)部門門]應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這一類新型環(huán)境污染物的重視，加強(qiáng)監(jiān)管.相關(guān)研究應(yīng)該集中在以下幾個(gè)方面:1.養(yǎng)殖業(yè)中抗生素抗性基因的RTQ-PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法體系的構(gòu)建;2.對(duì)國(guó)內(nèi)重點(diǎn)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行針對(duì)性調(diào)查，確認(rèn)我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的種類和污染水平，分析ARGs與抗生素環(huán)境選擇壓力之間的關(guān)系;3.開展養(yǎng)殖環(huán)境抗生素抗性基因的來源、擴(kuò)散和傳播規(guī)律研究，分析環(huán)境因素的變化如光照、溫度、pH以及氧對(duì)ARGs傳播擴(kuò)散的影響及機(jī)制;4.加強(qiáng)抗生素抗性基因?qū)?dòng)物和人體的健康風(fēng)險(xiǎn)研究，研究抗生素抗性與養(yǎng)殖動(dòng)物和人致病菌之間的關(guān)系，建立抗生素抗性基因生態(tài)環(huán)境安全評(píng)價(jià)和預(yù)警體系.參考文獻(xiàn)[1]SapkotaA,SapkotaAR,KucharskiM,etal.Aquaculturepracticesandpotentialhumanhealthrisks:currentknowledgeandfuturepriorities[J].EnvironmentInternational,2008,34(8):1215-26.[2]VanBoeckelTP,BrowerC,GilbertM,etal.Globaltrendsinantimicrobialuseinfoodanimals[].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2015,112(18):.5649-5654.[3]ZhangQQ,YingGG,PanCG,etal.ComprehensiveevaluationofantibioticsemissionandfateintheriverbasinsofChina:sourceanalysis,multimediamodeling,andlinkagetobacterialresistance[J].Environmentalscience&technology,2018,49(11):6772-6782.[4]TatavarthyA.ComparisonofantibioticsusceptibilityprofilesandmoleculartypingpatternsofclinicalandenvironmentalSalmonellaentericaserotypeNewport[J].JournalofFoodProtection,2019,(4):74