高效液相色譜知識收藏

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Agilent1100高壓液相色譜儀基本操作步驟AgilentllOO液相基本操作步驟

AgilentllOO高壓液相色譜儀維護保養(yǎng)知識保養(yǎng)事項：

高壓液相色譜HPLC常見故障及排除方法

液相色譜柱使用及保養(yǎng)

高壓液相色譜HPLC培訓(xùn)教程（一）

高壓液相色譜HPLC培訓(xùn)教程（七）

高效液相色譜儀中反相HPLC柱子的清潔和再生

HPLC對流動相的基本要求

高效液相色譜

Waters600E-2487HPLC系統(tǒng)SOPWaters高效液相色譜系統(tǒng)操作規(guī)程

高效液相色譜儀（Agilent1100）操作注意事項

色譜掃盲班

AgilentllOO高壓液相色譜儀基本操作步驟Agilent1100液相基本操作步驟

（一）、開機：

1、打開計算機,進入WindowsNT（或Windows2000）畫面，并運行Bootp

Server程序。

2、打開1100LC各模塊電源。

3、待各模塊自檢完成后，雙擊Instrument1Online圖標，化學(xué)工

作站自動與1100LC通訊，進入的工作站畫面。

4、從“View”菜單中選擇uMethodandRuncontrolw畫面，單擊”

View”菜單中的“ShowTopToolbarn,aShowstatustoolbarwuSystem

diagram"，"Samplingdiagram”，使其命令前有"J”標志，來調(diào)用所需的

界面。

5、把流動相放入溶劑瓶中。

6、打開Purge閥。

7、單擊Pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setuppump選項，進入泵

編輯畫面。

8、設(shè)Flow：5ml/min,單擊OK。

9、單擊Pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Pumpcontrol選項，選中

On,單擊0K,則系統(tǒng)開始Purge,直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為

止,切換通道繼續(xù)Purge,直到所有要用通道無氣泡為止。

10、單擊Pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊PumpControl選項，選中

Off,單擊0k關(guān)泵，關(guān)閉Purgevalve。

11、單擊Pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setuppump選項，進入Pump

編輯畫面，設(shè)Flow：1.0ml/mino

12、單擊泵下面的瓶圖標，輸入溶劑的實際體積和瓶體積。也可輸入停泵

的體積。單擊Ok。

（二）數(shù)據(jù)采集方法編輯：

1、開始編輯完整方法：

?從“Method”菜單中選擇"Editentiremethod,,項，如上圖所

示選中除“Dataanalysis”外的三項，單擊0k,進入下一畫面。

2、方法信息：

?在“MethodComments,,中加入方法的信息（如：方法的用途等）。

?單擊0k進入下一畫面。

3、泵參數(shù)設(shè)定：（以二元泵為例）

?在“Flow”處輸入流量，如Iml/min,在“SolventB”處輸入

70.0,（A=100-B），也可Insert一行"Timetable”，編輯梯度。在Pressure

LimitsMax”處輸入柱子的最大耐高壓，以保護柱子。

?單擊0k進入下一畫面。

4、自動進樣器參數(shù)設(shè)定：

?選擇合適的進樣方式，進樣體積l.Oul,洗瓶位置為6號。

uStandardInjection只能輸入進樣體積，此方式無洗針功能。"Injection

withNeedleWash”一一可以輸入進樣體積和洗瓶位置，此方式針從樣品瓶抽

完樣品后，會在洗瓶中洗針。"Useinjectorprogram--可以點擊Edit鍵

進行進樣程序編輯。

?點擊0k進入下一畫面。

5、柱溫箱參數(shù)設(shè)定:

?在"Temperature”下面的方框內(nèi)輸入所需溫度，并選中它，點擊”

more〉”鍵，如圖所示，選中"Sameasleft"—-使柱溫箱的溫度左右一致。

?點擊ok進入下一畫面。

6、VWD檢測器參數(shù)設(shè)定：

?在"Wavelength”下方的空白處輸入所需的檢測波長，如

254nm,在“Peakwidth(Responsetime)”下方點擊下拉式三角框，選擇合

適的響應(yīng)時間，如＞0.lmin(2s)。

?在Timetable中可以“Insert”一行，輸入隨時間切換的波

長，如Imin,波長二300nm。點擊ok進入下一畫面。

7、DAD檢測器參數(shù)設(shè)定：

?檢測波長：254nm,BW=30nm,參比波長

=350nm,BW=100nm;

?檢測波長：一般選擇最大吸收處的波長。樣品帶寬BW：一般

選擇最大吸收值一半處的整個寬度。參比波長：一般選擇在靠近樣品信號的無

吸收或低吸收區(qū)域。參比帶寬BW：至少要與樣品信號的帶寬相等，許多情況下

用100nm作為缺省值。Peakwidth(Responsetime)：其值盡可能接近要測的

窄峰峰寬。Slit一狹縫窄，光譜分辨率高；寬時，噪音低。同時可以輸入采集

光譜方式，步長，范圍，閾值c選中所用的燈。

?點擊0k進入下一畫面。

8、RID檢測器參數(shù)設(shè)定：

?色譜條件：

進樣體積：20ulo光學(xué)單元溫度：Offo

極性：正c峰寬（響應(yīng)時

間）：4s

?aOpticalUnitTemperaturev--若環(huán)境溫度控制在±2℃,

設(shè)定為Off,若環(huán)境溫度不穩(wěn)定,則設(shè)定光學(xué)單元溫度為高于環(huán)境溫度5度，

以防樣品在池中沉淀。"Peakwidth”--大多數(shù)分析設(shè)為4S,只有在高速分析

下設(shè)為更短。"Automaticrecyclingafteranalysis”在不進行分析時可

以讓流動相循環(huán)，節(jié)省流動相，檢測器連續(xù)運行，可隨時投入使用。

?點擊RID圖標，選擇RIDControl：Heater設(shè)為On,若要

循環(huán)流動相,必須將"RecyclingValve"設(shè)為ON。手動purge參比池,將其

設(shè)為On,并輸入Purge時間。

9、FLD檢測器參數(shù)設(shè)定：

色譜條件:

樣品：P/N01018-68704用甲醇稀釋為1:10。

進樣體積：5ulo

柱溫箱：30℃oEX=246nm,

EM=317nm,PMT=10o

響應(yīng)時間=4s.停止時間：出峰完畢。

ExcitationA:激發(fā)波長：200-700nm,步長為Inm,

或ZeroOrdero

Emission:發(fā)射波長：280-900nm,步長為Inm,

或ZeroOrdero

PMT:大多數(shù)應(yīng)用適當?shù)脑O(shè)定值為10,若高濃度樣

品峰被切平頭，則減少PMT值,

“Peakwidth”：大多數(shù)應(yīng)用設(shè)為4s,只有快速分析采

用小的設(shè)定值。

?MultiEx：多波長及光譜（激發(fā)）。

?MultiEm：多波長及光譜（發(fā)射）。

?同時可以輸入范圍Range、步長step、采集光譜。

10^在“Runtimechecklist"中選中"Dataacquisition^,

單擊Oko

11、單擊“Method”菜單，選中“Savemethodas"，輸入一方法

名，如“test”，單擊Oko

12^從菜單“View"中選中"Onlinesignalw，選中Windows1,

然后單擊Change鈕,將所要繪圖的信號移到右邊的框中，點擊Ok.（如同時檢測

二個信號，則重復(fù)12,選中Windows2）o

13>從"Runcontrol”菜單中選擇"Sampleinfo”選項，如

上圖所示,輸入操作者名稱,在"Datafile"中選擇"Manual"或"Prefix”。

區(qū)別：Manual—每次做樣之前必須給出新名字,否則儀器會將上

次的數(shù)據(jù)覆蓋。Prefix一在Prefix框中輸入前綴，在Counter框中輸入計數(shù)

器的起始位，儀器會自動命名，如vwdOOOl,vwd0002……。

14、從Instrument菜單選擇Systemon。

15>等儀器Ready,基線平穩(wěn),從Method菜單中選擇"Runmethod”，

進樣。

（三）、數(shù)據(jù)分析方法編輯:

1、從"View”菜單中，單擊“Dataanalysis,,進入數(shù)據(jù)分析畫面。

2、從“File”菜單選擇“Loadsignal”，選中您的數(shù)據(jù)文件名，如下

圖所示。單擊0k。

3、做譜圖優(yōu)化,從“Graphics”菜單中選擇“Signaloptions”選項，。

從Ranges中選擇Autoscale及合適的顯示時間，單擊ok,或選擇”UseRanges”

調(diào)整。反復(fù)進行，直到圖的比例合適為止。

4、積分：

(1)、從"Integration"中選擇"Autointegrate”,如積分結(jié)果

不理想，再從菜單中選擇“IntegrationEvents”選項，選擇合適的Slope

sensitivity,Peakwidth,Areareject,Heightrejecto

(2)、從"Integration”菜單中選擇"Integrate”選項，則數(shù)

據(jù)被積分。

(3)、如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)，直到滿意為止。

(4)、單擊左邊“J”圖標，將積分參數(shù)存入方法。

5、打印報告：

(1)、從"Report”菜單中選擇"Specifyreportw選項，進入如

上畫面。

(2)、單擊uQuantitativeResults”框中Calculate右側(cè)的黑

三角，選中Percent(面積百分比)，其它選項不變。

(3)、單擊0k.

⑷、從"Report"菜單中選擇"Printreport"，則報告結(jié)果將

打印到屏幕上，如想輸出到打印機上，則單擊Report底部的“Print”鈕。

（四）、關(guān)機:

?關(guān)機前，用100%的水沖洗系統(tǒng)20分鐘，然后用有機溶劑沖

洗系統(tǒng)10分鐘（如ACN）,然后關(guān)泵，（適于反相色譜柱）。［正相色譜柱用適

當?shù)娜軇_洗］

?退出化學(xué)工作站，及其它窗口，關(guān)閉計算機（用shutdown

關(guān)）。

關(guān)掉Agilent1100電源開關(guān)。

AgilentllOO高壓液相色譜儀維護保養(yǎng)知識保養(yǎng)事項：

1、色譜柱長時間不用，存放時，柱內(nèi)應(yīng)充滿溶劑，兩端封死（如ACN適于反相

色譜柱，正相色譜柱用相應(yīng)的有機相）

2、對于手動進樣器，當使用緩沖溶液時，要用水沖洗進樣口，同時搬動進樣閥

數(shù)次，每次數(shù)毫升。

3、流動相使用前必須過濾，不要使用多日存放的蒸儲水（易長菌）。

4、帶seal-wash的1100,要配制90%水+10%異丙醇，以每分2—3滴的速度虹

吸排出，溶劑不能干涸。

5、其它主意事項見說明書，或由現(xiàn)場工程師介紹。

維護知識問答

1、為什么溶劑和樣品要過濾？

溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護作用，消除由

于污染對分析結(jié)果的影響。

色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使

色譜柱和毛細管容易堵塞。

儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵

頭內(nèi)的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。

樣品過濾頭的類型：

30mn內(nèi)徑：適用于大進樣量的過濾，由0.2Rm和0.4511m兩種規(guī)格，材料有纖

維素，醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50口1。

13mn內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.2um和0.45nm兩種規(guī)格，材料為纖維

素。

3nlm內(nèi)徑：適用于小進樣量的過濾，由0.2um和0.45Um兩種規(guī)格。處理樣品

體積為7

濾膜類型：

聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。

醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和

其相關(guān)樣品。

尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可用于強酸，70%乙醇、二

氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。

再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機溶劑。

2、為什么HPLC用緩沖鹽時要加在線Seal-wash選項？

HPLC用緩沖鹽時，由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象,析出的

細小鹽粒非常堅硬,它附著在藍寶石活塞桿上,隨著藍寶石活塞桿的往復(fù)運動，

容易產(chǎn)生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現(xiàn)象。在線Seal-wash選項能有

效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。緩沖鹽的濃度在0.Imol或大于0.Imol時,必

須使用該在線沖洗選項.

清洗液配制：90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類生長和減小水

的表面張力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。

3、為什么AgilentU00LC的流動相管路非常細？

在使用HPLC時,應(yīng)特別注意”柱外效應(yīng)”對分析結(jié)果的影響，由于樣品

分子在液體流動相中的擴散系數(shù)比在氣體中小4~5個數(shù)量級，液體流動相的流

速也比氣相慢「2個數(shù)量級。因此，樣品進入色譜柱后，在柱子以外的任何死

體積（進樣器、柱接頭、連接管、檢測器）中，樣品分子的擴散和滯留，都會

引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之最小，獲得理想的分析

結(jié)果，Agilent1100LC使用加工工藝難度高的毛細管線作為流動相管路。

毛細管線分類：0.17mm內(nèi)徑------綠色；0.12mm內(nèi)徑-------紅

色。

PEEK管線：內(nèi)徑-----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mmo

毛細管線優(yōu)點：柔韌性好.

^Agilent公司同時備有l(wèi)/16in的粗外徑毛細管線，適用于不同習(xí)慣的用戶，

優(yōu)點是剛性好，但柔韌性差一些。

4、流動相使用前為什么要脫氣？

流動相使用前必須進行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如02）,

以防止在洗脫過程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。

氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)

致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD,

可能會造成熒光猝滅。

常用的脫氣方法比較：

氯氣脫氣法：利用液體中氯氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氮脫氣，效果較好，

但成本高。

加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。

抽真空脫氣法：易抽走有機相C

超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min,此法效果最

差。

在線真空脫氣法：AgilentllOOLC真空脫機利用膜滲透技術(shù)，在線脫氣，智能

控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多

元溶劑體系。

5、如何防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？

溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類的生長會堵塞溶劑過濾器，從而影響泵的運

行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=4一7）。以下幾種方法可以有效防止溶劑

瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞。

A：請嚴格執(zhí)行溶劑過濾。

B：請勿使用多日存放的蒸儲水及磷酸鹽緩沖液

C：如果應(yīng)用許可，可在溶劑中加入0.0001--0.001M的疊氮化鈉.

D:在溶劑瓶內(nèi)溶劑的上方小流量連續(xù)吹鼠氣，以隔絕空氣。

E：避免使溶劑瓶暴露在直射陽光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷

酸鹽緩沖液。

堵塞后的處理法方法：將過濾頭從組件中取下，在濃硝酸（35%）中浸

泡lh,然后用二次蒸儲水沖洗干凈并超聲處理。

6^Agilent1100LC泵如何維護?

Agilent1100LC泵給色譜柱提供穩(wěn)定、無脈動、流量準確的流動相，及

時合理的維護非常重要。

A：流動相使用前請必須脫氣、過濾。

B：使用緩沖鹽時，要加在線Seal-wash選項。

C：關(guān)機前，用100%的水沖洗系統(tǒng)20分鐘，然后用有機溶劑沖洗系統(tǒng)10分鐘

（如甲醇），然后關(guān)泵，（適于反相色譜柱）。［正相色譜柱用適當?shù)娜軇_洗］

D：及時更換PurgeValve內(nèi)的過濾芯。（當打開PurgeValve時,壓力高于lObar,

表明過濾芯已堵?）。E：使用合適的密封圈。

7、如何選擇合適的泵頭活塞密封圈？

泵頭活塞的標準密封圈能適合于大多數(shù)應(yīng)用，但使用正相溶劑（如正己

烷），不適合使用標準活塞密封圈，特別是長時間使用時，需更換另一種不同

的密封圈，我們建議使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n0905T4202/pk）

***注意：聚四氟乙烯密封圈的壓力范圍為：0—200bar；建議在泵的壓力限制

中，將最大壓力設(shè)為200bar。

8、使用梯度比例發(fā)時要注意那些事項？

當鹽溶液與有機溶劑溶液混合時，鹽溶液能與有機溶劑溶液完全混溶，

而不會出現(xiàn)沉淀。但是在比例閥的混合點，重力作用使鹽顆粒沉淀下來，通常,

閥A接水相/鹽溶液，D接有機溶劑，此法連接可有效使鹽回落到鹽溶液中，并

被溶解。若顛倒過來，鹽可能落在有機溶劑中，出現(xiàn)問題。

強烈建議：當使用緩沖鹽溶液和有機溶劑時，推薦將緩沖鹽通道接在A

通道上，有機溶劑通道直接接在A通道的上方D通道上：定期用水沖洗所有的

通道，以除去閥口上可能出現(xiàn)的鹽沉淀。

9、在線真空脫氣機使用要注意那些事項？

一般來說，Agilent1100LC的真空脫氣機無需過多維護，只需注意幾

個注意事項就可以了。

A：第一次使用，要用隨儀器附帶的注射器抽滿脫氣機腔體；更換不同類型的溶

劑時，要先抽空，再抽滿。

B：不用的通道要充滿溶劑或密閉起來。

10、更換色譜柱時要注意什么事項？

在使用HPLC時,應(yīng)特別注意“柱外效應(yīng)”對分析結(jié)果的影響，由于樣品

分子在液體流動相中的擴散系數(shù)比在氣體中小4~5個數(shù)量級，液體流動相的流

速也比氣相慢—2個數(shù)量級。因此，樣品進入色譜柱后，在柱子以外的任何死

體積（進樣器、柱接頭、連接管、檢測器）中，樣品分子的擴散和滯留，都會

引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之最小，獲得理想的分析

結(jié)果，儀器的流動相管路連接非常重要，一般AgilentU00LC在第一次安裝時,

均有受過專業(yè)培訓(xùn)的安裝工程師負責安裝,各種接頭會處理的非常完美?？蛻糁?/p>

需在更換色譜柱時注意接頭處理就可以了，一般柱子入口接頭為不銹鋼卡套接

頭，柱子出口為不銹鋼卡套接頭或PEEK管線手擰街頭，當完成第一次安張后，

不銹鋼卡套已固定死，當接不同的柱子時，要注意柱子接頭處的形狀和長度，

否則會產(chǎn)生一個非常大的死體積。

11、手動進樣閥需做那些維護，使用時要注意什么？

對于手動進樣器，當使用緩沖溶液后，或者進濃度差異比較大的樣品時

要用專用工具而不是用帶針頭的注射器沖洗進樣口，同時搬動進樣閥數(shù)次，每

次數(shù)毫升。

注意事項：

?安裝時六通閥的5,6出口要與注射器在同一水平線上，以防止虹吸

現(xiàn)象的發(fā)生，導(dǎo)致進樣量的重復(fù)性變異。

?進樣量的多少要根據(jù)定量管的LOOP體積決定。

當樣品量少時：進樣體積由注射器的進樣體積決定，但最大進樣體積要

小于l/21oop體積。

當樣品量較多時：進樣體積由定量管的體積決定，為保證樣品完全把定

量管的流動相置換干凈，需注射5—6倍的LOOP體積。

?要使用專用的液相注射器進樣，絕對不可以用氣相的注射器。

高壓液相色譜HPLC常見故障及排除方法診狀

（一）保留時間變化

可能的原因：解決方法

1.柱溫變化：柱恒溫

2.等度與梯度間未能充分平衡：至少用10倍柱體積的流動相平衡柱

3.緩沖液容量不夠：用＞25mmol/L的緩沖液

4.柱污染：每天沖洗柱

5.柱內(nèi)條件變化：穩(wěn)定進樣條件，調(diào)節(jié)流動相

6.柱快達到壽命：采用保護柱

（二）保留時間縮短

可能的原因：解決方法

1.流速增加：檢查泵，重新設(shè)定流速

2.樣品超載：降低樣品量

3.鍵合相流失：流動相PH值保持在3、7.5檢查柱的方向

4.流動相組成變化：防止流動相蒸發(fā)或沉淀

5.溫度增加：柱恒溫

（三）保留時間延長

可能的原因：解決方法

L流速下降：管路泄漏，更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡

2.硅膠柱上活性點變化：用流動相改性劑，如加三乙胺，或采用堿至鈍化柱

3.鍵合相流失：同前（二）3

4.流動相組成變化：同前（二）4

5.溫度降低：同前（二）5

（四）出現(xiàn)肩峰或分叉

可能的原因：解決方法

1.樣品體積過大：用流動相配樣，總的樣品體積小于第一峰的15%

2.樣品溶劑過強：采用較弱的樣品溶劑

3.柱塌陷或形成短路通道：更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件

4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效：更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器，過濾樣品

5.進樣器損壞：更換進樣器轉(zhuǎn)子

（五）鬼峰

可能的原因：解決方法

L進樣閥殘余峰：每次用后用強溶劑清洗閥，改進閥和樣品的清洗

2.樣品中未知物：處理樣品

3.柱未平衡：重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑（尤其是離子對色譜）

4.三氟乙酸（TFA）氧化（肽譜）：每天新配，用抗氧化劑

5.水污染（反相）：通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水

（六）基線噪聲

可能的原因：解決方法

L氣泡（尖銳峰）：流動相脫氣，加柱后背壓

2.污染（隨機噪聲）：清洗柱，凈化樣品，用HPLC級試劑

3.檢測器燈連續(xù)噪聲：更換笊燈

4.電干擾（偶然噪聲）：采用穩(wěn)壓電源，檢查干擾的來源（如水浴等）

5.檢測器中有氣泡：流動相脫氣，加柱后背壓

（七）峰拖尾

可能的原因：解決方法

L柱超載：降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相

2.峰干擾：清潔樣品，調(diào)整流動相

3.硅羥基作用加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,

鈍化樣品

4.同前（四）4:同前（四）4

5.同前（四）35.:同前（四）3

6.死體積或柱外體積過大：連接點降至最低，對所有連接點作合適調(diào)整，盡可

能采用細內(nèi)徑的連接管

7.柱效下降：用較低腐蝕條件,更換柱，采用保護柱

（八）峰展寬

可能的原因：解決方法

L進樣體積過大：同（四）1

2.在進樣閥中造成峰擴展：進樣前后排出氣泡以降低擴散

3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢：設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點

4.檢測器時間常數(shù)過大：設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%

5.流動相粘度過高：增加柱溫，采用低粘度流動相

6.檢測池體積過大：用小體積池,卸下熱交換器

7.保留時間過長：等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫

8.柱外體積過大：將連接管徑和連接管長度降至最小

9.樣品過載：進小濃度小體積樣品

液相色譜柱使用及保養(yǎng)液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部

分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液

相色譜工作者獲得正確可靠的實驗數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。

一、液相色譜柱的安裝：

1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：

a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。

柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸

外螺紋，另一端是3/16英寸的內(nèi)螺紋（國內(nèi)外已規(guī)范化）。7/16英寸外螺紋與

1/4英寸柱管（①6.35mm）連接，中間放置壓壞用于密封。3/16英寸的內(nèi)螺紋

與1/16英寸（①1.57mm）的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。

為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用①1.57m皿連接管通過空心螺釘

壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍

在連接管上（連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴格控制在2.5mm長或其他固

定尺寸）。

在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片（或濾網(wǎng)），用于封堵柱

填料不被流動相沖出柱外而流失?？罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一

般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意,

柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。

b、柱填料:

液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的，柱子的分類是依據(jù)

填料類型而定。

正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒

直徑在3—10um的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合一CN,-NH2等官

能團即所謂的鍵合相硅膠。

反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團（ODS）的非

極性填料。也有無定型和球型之分。

常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—

10Um之間。

2,色譜柱的安裝：

a、拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的

溶劑。

b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。

c、按柱管上標示的流動相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥

出口相連接（如條件允許，建議在柱前使用保護柱）；柱的出口與檢測器連接。

連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空

心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過空心

螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為止，

再用扳手繼續(xù)順時針擰1/4-1/2圈，切記不要用力過大。如色譜柱通過流動

相加壓后有漏液現(xiàn)象，請用扳手繼續(xù)順時針擰1/4圈，直至不漏液為止。

二、液相色譜柱的使用：

色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結(jié)昊保存起來，作為今后

評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、

柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報

告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是最佳條件），只有這樣，測得的結(jié)果

才有可比性。

1、樣品的前處理：

a、最好使用流動相溶解樣品。

b、使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。

c、使用0.45um的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。

2、流動相的配制：

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目

的，因此要求流動相具備以下的特點：

a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或

長時間保留在柱中）。

b、流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)（特殊情況除外）。

c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離

效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流

動相的黏度）。

d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，最好

使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進行。

f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣

體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

3、流動相流速的選擇：

因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱

效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內(nèi)徑為

4.6nm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min,對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml

/min為佳。

當選用最佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊?/p>

方法以縮短分析時間（如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙睛的含量）。

注意：

a.由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系（必須使用乙月青的場合除

外）。

b.對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油酸或提純后的己烷作流動

相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水（電阻率大于18兆歐），去

離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。

c.含水流動相最奸在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相

不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細菌生長。

d.流動相要求使用0.45um濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。

e.使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用

壽命，提高柱性能。

4、柱性能測試：

啟動液相色譜儀：a、流動相流速設(shè)定為1ml/min。

b、UV檢測器波長設(shè)定為254nm。

使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品。

記錄并計算測試結(jié)果。

*參考(標準JB5226-91)液相色譜儀測試用標準色譜柱。

高壓液相色譜HPLC培訓(xùn)教程(一)I.概論

一、液相色譜理論發(fā)展簡況

色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定

相時,由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用(吸附、分配、離子吸引、

排阻、親和)的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定

相中流出。又稱為色層法、層析法。

色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特(Tswett)在1906年研究用碳酸

鈣分離植物色素時發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)

上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。

液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差

輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長(常有幾個小時)。

高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)是在經(jīng)典

液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。

它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引

起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquid

Chromatography,IIPLC)o又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(HighSpeed

LiquidChromatography,HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。

二、HPLC的特點和優(yōu)點

HPLC有以下特點：

高壓-壓力可達15(f300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。

高速-流速為0.P10.0ml/mino

高效-可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。

高靈敏度-紫外檢測器靈敏度可達0.Olngo同時消耗樣品少。

HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：

速度快-通常分析一個樣品在15~30min,有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。

分辨率高-可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。

靈敏度高-紫外檢測器可達0.Olng,熒光和電化學(xué)檢測器可達0.Ipgo

柱子可反復(fù)使用-用一根色譜柱可分離不同的化合物。

樣品量少，容易回收-樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

三、色譜法分類

按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色

譜法適用于分離揮發(fā)性化合物cGC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)

和氣液色譜法(GLC),其中以GLC應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或

非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)cLC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法

(LLC)o此外還有超臨界流體色譜法(SFC),它以超臨界流體(界于氣體和液體

之間的一種物相)為流動相(常用C02),因其擴散系數(shù)大，能很快達到平衡，

故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。

按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、

排阻色譜法(EC,又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC)和親和

色譜法，此外還有電泳。按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、

柱色譜法。

四、色譜分離原理

高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜

法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。

1.液固色譜法

使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分

吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附一解吸附的平衡過程。常用的吸

附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10um。適用于分離分子量2001000的組分，大

多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。

2.液液色譜法

使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔體表面，或化學(xué)鍵合于擔體表面而形成的

固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。

分離過程是一個分配平衡過程c

涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固定相飽和，以減

少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的

變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布

式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固

定相，如C18、C8、氨基柱、氟基柱和苯基柱。

液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法（NPC）和反

相色譜法（RPC）。

正相色譜法

采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與月青基鍵合相）；流動相為相對非極

性的疏水性溶劑（烷燒類如正己烷、環(huán)己烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫吠喃、

三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物

（如酚類、胺類、粉基類及氨基酸類等）。

反相色譜法

一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲

醇、乙庸、異丙醇、丙酮、四氫吠喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。

適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，

據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。

隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應(yīng)用于

某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖

液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5V.5

（2'8）,太高的pH值會使硅膠溶解,太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報

告新商品柱可在pH1.5~10范圍操作。

正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜

法反相色譜法

固定相極性高?

中中?低

流動相極性低?

中中?高

組分洗脫次序極性小先洗

出極性大先洗出

從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如

氨基鍵合固定相）。

3.離子交換色譜法

固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，

在表面未端芳環(huán)上接上竣基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子

交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中

具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換

基團具有不同的電荷吸引力而分離。

緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保

留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關(guān)外，它還受流動相

的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相

的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較

快流出。

離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

4.離子對色譜法

又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離

子束試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從

而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質(zhì)。

分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺

酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。

分析酸性物質(zhì)常用四丁基季錢鹽，如四丁基溟化鉞、四丁基鏤磷酸鹽。

離子對色譜法常用ODS柱（即C18）,流動相為甲醇-水或乙月青-水，水

中加入310mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進行分離。被測組分

保時間與離子對性質(zhì)、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關(guān)。

5.排阻色譜法

固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小

分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長：大分子量的化合物不能進入孔中，

直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異

而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸

等。

高壓液相色譜HPLC培訓(xùn)教程(二)II.基本概念和理論

一、基本概念和術(shù)語

1.色譜圖和峰參數(shù)

色譜圖(chromatogram)一樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，

又稱色譜流出曲線(elutionprofile)o

基線(baseline)一經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時

間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時間軸。

噪音(noise)一基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)

定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。

漂移(drift)一基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動

相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂

移。

色譜峰(peak)一組分流經(jīng)檢測器時響應(yīng)的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的

突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線(高斯Gauss曲線)。不對

稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)<>前者少見。

拖尾因子(tailingfactor,T),用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子

(symmetryfactor)或不對稱因子(asymmetryfactor)o《中國藥典》規(guī)定T應(yīng)

為0.95~1.05。TV0.95為前延峰,T>1.05為拖尾峰。

峰底-基線上峰的起點至終點的距離。

峰高(peakheight,h)一峰的最高點至峰底的距離。

峰寬(peakwidth,W)-峰兩側(cè)拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。

W=4o

半峰寬(peakwidthathalf-height,Wh/2)一峰高一半處的峰寬。Wh/2=2.355

o

標準偏差(standarddeviation,。)-正態(tài)分布曲線x=±1時(拐點)的峰寬

之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色

譜柱過程中的分散程度。。小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；

反之，。大，峰形胖、柱效低c

峰面積(peakarea,A)-峰與峰底所包圍的面積。

2.定性參數(shù)(保留值)

死時間(deadtime,tO)一不保留組分的保留時間。即流動相(溶劑)通過色譜

柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。

死體積(deadvolume,V0)—由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據(jù)

的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙(被

流動相占據(jù)、Vm)、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色

譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應(yīng)盡

量減小。V0=FXt0(F為流速)

保留時間(retentiontime,tR)一從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大

值的時間。

保留體積(retentionvolume,VR)一從進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大

值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR=FXtR

調(diào)整保留時間(adjustedretentiontime,t'R)--扣除死時間后的保留時間。

也稱折合保留時間(reducedretentiontime)o在實驗條件(溫度、固定相等)

一定時，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R(或tR)可用于定性。t，R=tR

-to

調(diào)整保留體積(adjustedretentionvolume,V'R)一扣除死體積后的保留體積。

3.柱效參數(shù)

理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber,N)--用于定量表示色譜柱的分離效率

(簡稱柱效)。

N取決于固定相的種類、性質(zhì)(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、柱長、流動相

的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。在一張多組分色譜圖上，如果各組

分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。

用半峰寬計算理論塔數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測

定，尤其是對稍有拖尾的峰。

N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應(yīng)注明柱長，如果未注明，

則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。(一般HPLC柱的N在1000以上。)

若用調(diào)整保留時間(fR)計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或

Neff)o

理論塔板高度(theoreticalplateheight,H)—每單位柱長的方差。實際應(yīng)用

時往往用柱長L和理論塔板數(shù)計算。

4.相平衡參數(shù)

分配系數(shù)(distributioncoefficient,K)一在一定溫度下，化合物在兩相間達

到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。

分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力

有關(guān)。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離

子交換色譜法為選擇性系數(shù)（或稱交換系數(shù)），凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般

情況可用分配系數(shù)來表示。

在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、

Cm很?。r，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜

條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增

大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時

色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒

定時，才能獲得正常峰。

在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流

出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配

系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離

的前提。

在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質(zhì)影響。實踐中主要靠

調(diào)整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時

間，達到分離的目的。

容量因子（capacityfactor,k）一化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相

與流動相中的量之比。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。

容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（t'R）是

不保留組分保留時間（tO）的幾倍。k=0時，化合物全部存在于流動相中，在

固定相中不保留，t'R=0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，

保留時間越長。

容量因子與分配系數(shù)的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性

質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關(guān)：k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有

關(guān)。由于t'R、tO較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。

選擇性因子(selectivityfactor,a)一相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之

比。a又稱為相對保留時間(《美國藥典》)。

要使兩組分得到分離，必須使aWl。a與化合物在固定相和流動相中

的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，a

的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用

力的差異。

5.分離參數(shù)

分離度(resolution,R)一相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分

辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R=o當W1=W2時，R=o當R=1時，稱為4

。分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4臨內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。R=L5時,

稱為6。分離，裸露峰面積為99.7%。R21.5稱為完全分離。

中國藥典規(guī)定R應(yīng)大于1.5o

提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣

會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加

選擇性。當a=1時，，R=0,無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采

取以下措施來改變選擇性：a.改變流動相的組成及pH值；b.改變柱溫；c.改

變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)

節(jié)流動相的組成來實現(xiàn)。k2趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2

不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏

度。一般k2在廣10范圍內(nèi)，最好為2~5,窄徑柱可更小些。

高壓液相色譜HPLC培訓(xùn)教程（三）二、塔板理論

1.塔板理論的基本假設(shè)

塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論。它把色

譜柱看作分儲塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過程看成在分儲塔中的分儲過程，

即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過程。塔板理論的基本假設(shè)為：

1）色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配

定律，并很快達到分配平衡。

2）樣品加在第0號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。

3）流動相在色譜柱內(nèi)間歇式流動，每次進入一個塔板體積。

4）在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關(guān)。

雖然以上假設(shè)與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態(tài)過程，很難

達到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。但是塔板理論導(dǎo)出

了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點的位置，能

夠評價色譜柱柱效。

2.色譜流出曲線方程及定量參數(shù)（峰高h和峰面積A）

由色譜流出曲線方程可知：當1=11?時，濃度C有極大值。Cmax就是色

譜峰的峰高。因此：①當實驗條件一定時（即。一定），峰高h與組分的量CO

（進樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當進樣量一定時，

。越?。ㄖг礁撸?，峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。

由流出曲線方程對V（0、8）求積分，即得出色譜峰面積A。可見A相當

于組分進樣量CO,因此是常用的定量參數(shù)。把^^=11和陽1/2=2.355。代入

上式，即得A=1.064XWh/2Xh,此為正常峰的峰面積計算公式。

三、速率理論（又稱隨機模型理論）

1.液相色譜速率方程

1956年荷蘭學(xué)者VanDeemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔

板高度的動力學(xué)因素結(jié)合起來，提出了色譜過程的動力學(xué)理論一速率理論。它

把色譜過程看作一個動態(tài)非平衡過程，研究過程中的動力學(xué)因素對峰展覽（即

柱效）的影響。

后來Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程（后稱氣相色譜速率

方程）的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即

Giddings方程）.

2.影響柱效的因素

1）渦流擴散（eddydiffusion）o由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子

在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴散項A=2Xdp,dp為填料直徑,

人為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻入越大。HPLC常用填料粒度一般為：CIOu

m,最好3~5um,粒度分布RSDW5%。但粒度太小難于填充均勻（入大），且會

使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，入越小。

總的說來，應(yīng)采用細而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細管無填料，A=

Oo

2）分子擴散（moleculardiffusion）o又稱縱向擴散。由于進樣后溶質(zhì)分子

在柱內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴散而引起的峰展寬。分子擴散項B/u=2丫

Dm/uou為流動相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時間越長（u?。?，展寬越嚴重。

在低流速時，它對峰形的影響較大。Dm為分子在流動相中的擴散系數(shù)，由于液

相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5,因此在HPLC中，只要流速不太低的

話，這一項可以忽略不計。Y是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向

擴散，而引入的柱參數(shù)，用以對Dm進行校正。Y一般在0.6?0.7左右，毛細管

柱的Y=1。

3）傳質(zhì)阻抗（masstransferresistance）。由于溶質(zhì)分子在流動相、靜態(tài)流

動相和固定相中的傳質(zhì)過程而導(dǎo)致的峰展寬。溶質(zhì)分子在流動相和固定相中的

擴散、分配、轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達到平衡，實際傳質(zhì)速度是有限的，這一

時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜

的傳質(zhì)阻抗項Cu又分為三項。

①流動相傳質(zhì)阻抗Hm=Cmd2pu/Dm,Cm為常數(shù)。這是由于在一個流路中

流路中心和邊緣的流速不等所致?？拷畛漕w粒的流動相流速較慢，而中心較

快，處于中心的分子還未來得及與固定相達到分配平衡就隨流動相前移，因而

產(chǎn)生峰展寬。

②靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗Hsm=Csmd2pu/Dm,Csm為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)

分子進入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm

對峰展寬的影響在整個傳質(zhì)過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔

徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。所以改進固定相結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流

動相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。

Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2P成正比，與擴散系數(shù)Dm成反比。

因此應(yīng)采用低粒度固定相和低粘度流動相。高柱溫可以增大Dm,但用有機溶劑

作流動相時，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。

③固定相傳質(zhì)阻抗Hs=Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數(shù)，df為

固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴散系數(shù)。在分配色譜中Hs與df

的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層

固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采

用單分子層的化學(xué)鍵合固定相時Hs可以忽略。

從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措

施：①進樣時間要短。②填料粒度要小。③改善傳質(zhì)過程。過高的吸附作用力

可導(dǎo)致嚴重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當?shù)牧魉?。?/p>