飼料中總抗壞血酸的測定 編制說明

《飼料中總抗壞血酸的測定》（公開征求意見稿）一、工作簡況 31.1任務(wù)來源 31.2標(biāo)準(zhǔn)修訂背景 31.3主要工作過程 5二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù) 7（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則 7（二）標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù) 81.高效液相色譜法 1.2方法主要參數(shù)及試驗條件的確定 111.2.1檢測波長的選擇 1.2.2流動相的選擇 1.2.3流動相比例優(yōu)化 131.2.4流動相pH值優(yōu)化 141.2.5流速的選擇 1.2.6提取液濃度優(yōu)化 161.2.7提取方式優(yōu)化 1.2.8提取時間優(yōu)化 1.2.9還原劑的選擇 1.2.10干擾試驗 201.2.11儲備液穩(wěn)定性 201.3方法學(xué)考察 211.3.1線性范圍 211.3.2方法的檢出限和定量限 211.3.3方法回收率和精密度考察 231.3.4方法適用性 252鄰苯二胺熒光法 252.2方法學(xué)考察 262.2.1線性范圍 262.2.2方法的檢出限和定量限 272.2.3方法回收率和精密度考察 272.2.4不同檢測方法對比研究 27三、試驗驗證的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果 28四、與國際、國外同類標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容的對比情況，或者與測試的國外樣品、樣機的有關(guān)數(shù)據(jù)對比情況 29五、采標(biāo)情況，以及是否合規(guī)引用或采用國際國外標(biāo)準(zhǔn) 29六、與有關(guān)法律、法規(guī)的關(guān)系 29七、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù) 29八、涉及專利的有關(guān)說明 29九、貫徹國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，以及組織措施、技術(shù)措施、過渡期和實施日期的建議等措施建議29十、其他應(yīng)當(dāng)說明的事項 30根據(jù)《國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會關(guān)于下達(dá)2022年第一批推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)為國糧武漢科學(xué)研究設(shè)計院有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)由全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員為白色或微黃色晶體或粉末，無臭，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚、氯維生素C的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，經(jīng)歷了濃縮提取法、化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法三個階段。目前維生素C工業(yè)化生產(chǎn)采用我國在上生物發(fā)酵法”工藝技術(shù)路線，從L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸（以其為底物，經(jīng)酯化轉(zhuǎn)化后合成Vc）的生物轉(zhuǎn)化，是目前唯一應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的工藝路線。目前全球VC主要生產(chǎn)廠家均在中國，主要有石藥集團(tuán)（年產(chǎn)8.5萬噸）、山東95%、97%等規(guī)格，衣膜的包裹作用能夠降低維生素C在飼料加工過程中因高溫、濕、熱、擠壓等而造成的損失，也能在動物體內(nèi)動態(tài)緩慢釋放，持續(xù)發(fā)揮抗壞血酸按構(gòu)型分為L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸，其中L-抗壞血酸對機體具有生物活性，既是動物體內(nèi)多種代謝必不可少的輔助因子[1]，同時又是一種抗氧化劑和自由基清除劑，可以對機體起到保護(hù)作用，而D-異抗壞血酸基本不參與機體生理作用，多為寵物飼料中抗氧化劑，在自然界極少存在。動物自身不能合成抗壞血酸，故需要在飼料中添加以供應(yīng)機體所需。在家禽飼料中添加抗壞血酸，可有效緩解家禽因高溫、擁擠、疾病等引起的應(yīng)激反應(yīng)，對雞的產(chǎn)蛋率有良好的促進(jìn)作用[2]；在水產(chǎn)飼料中添加抗壞血酸，可促進(jìn)魚蝦的生長發(fā)育，提高抗病抗應(yīng)激能力，避免維生素E被破壞和油脂的氧化腐敗，對重金屬如銅、鋅、汞、砷等有解毒功能；在豬飼料中添加抗壞血酸，可有效減緩應(yīng)激，減少豬群的發(fā)病機會，增強仔豬的免疫力，提高公豬的精液品質(zhì)，提高母素及類維生素類飼料添加劑，適用范圍為所有養(yǎng)殖動物。2018年農(nóng)業(yè)部第21號公告規(guī)定，將D-異抗壞血酸作為抗氧化劑增補進(jìn)入《飼料添加劑品種目錄加劑L-抗壞血酸到《飼料添加劑品種目錄》的“抗氧化劑”類中，適用范圍為L型和D型抗壞血酸又分為還原型抗壞血酸和脫氫型抗壞血酸，兩者之間的轉(zhuǎn)化是可逆的[3]?？偪箟难釡y定的主要思路就是將L-抗壞血酸氧化為L-脫氫抗壞血酸或?qū)-脫氫抗壞血酸還原為L-抗壞血酸后，得到的L-抗壞血酸、L-脫氫抗壞血酸和D-異抗壞血酸總含量即為樣品中的總抗壞血酸含量。目前國內(nèi)測定樣品中抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)方法主要有滴定法、熒光法和液相法。GB5009.86-光法測定總抗壞血酸含量，該方法靈敏度高，但操作繁瑣，易受到干擾，且不能區(qū)分開L-抗壞血酸和和其同分異構(gòu)體D-異抗壞血酸。GB5009.86-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中抗壞血酸的測定》中采用2,誤差較大。GB5009.86-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中抗壞血酸的測定》、量，此方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，測試條件要求易于控制，但由于L-脫氫抗壞血酸只能在210nm處檢測，紫外檢測器對其靈敏度和選擇性都很低，因此液相色譜測定總抗壞血酸主要是將L-脫氫抗壞血酸轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸后，再用紫外國際上測定抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)方法主要有液相色譜法、熒光法、紫外法和毛細(xì)管電泳法等。ISO6557-1-1986標(biāo)準(zhǔn)采用分子熒光光譜法測定L-抗壞血酸和L-脫氫抗壞血酸的總含量。ISO20635:2018使用（超）高效液相色譜法和紫外法測定嬰兒和成人配方奶粉中L-抗壞血酸的含量。歐盟標(biāo)準(zhǔn)EN14130:2003采俄羅斯標(biāo)準(zhǔn)GOST31483-2012使用毛細(xì)管電泳法測定預(yù)混合料中抗壞血酸的含量。液相色譜法相對于其他方法來講，能區(qū)分測定不同構(gòu)型的抗壞血酸，前處理操作更為簡便高效、測定結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定。經(jīng)比較，液相色譜法與熒光法測定總抗壞血酸的結(jié)果無明顯差異。因此在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上補充液相法，以適應(yīng)我國國糧武漢科學(xué)研究設(shè)計院有限公司接到國家標(biāo)準(zhǔn)修訂任務(wù)后，成立了標(biāo)準(zhǔn)表1標(biāo)準(zhǔn)主要起草人員和任務(wù)分工任務(wù)分工工程師項目負(fù)責(zé)人，負(fù)責(zé)項目的全面工作工程師檢測方法研究、樣品檢測王博媛工程師檢測方法研究、樣品檢測陳夢瑩工程師檢測方法研究、樣品檢測陳析羽助理工程師標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明編寫和完善劉小敏副研究員技術(shù)顧問、標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明修改嚴(yán)宏岳工程師檢測方法研究宿永波工程師檢測方法研究邱惠娟工程師檢測方法研究2024年初，標(biāo)準(zhǔn)編制小組查閱了國內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)資料，制定了標(biāo)準(zhǔn)修訂內(nèi)容和技術(shù)路線草案。2024年2月，國糧武漢科學(xué)研究設(shè)計院有限公司組織圖1標(biāo)準(zhǔn)修訂技術(shù)路線圖2024年3月~2023年8月，開展樣品收集、方法學(xué)研究和方法適用性考察2023年10月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組完成標(biāo)準(zhǔn)文本、編制說明定向征求意見稿編2025年1月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組開展定向征求意見、3家檢測機構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)驗證工定和要求編寫標(biāo)準(zhǔn)全文。查閱了國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)存在的問題，新增高效液相色譜法，補充熒光法的定量限，有效提升標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性、將文件名稱《飼料中總抗壞血酸的測定領(lǐng)苯二胺熒光法》改為《飼料中抗壞血義；更改了鄰苯二胺熒光法分析結(jié)果的計算及表示；增加了高效液相色譜測定表2標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容修訂說明序號1《飼料中總抗壞血酸的測定鄰苯二胺熒光抗壞血酸存在同分異構(gòu)體，領(lǐng)苯二胺熒光法不能區(qū)分測定不同構(gòu)型的抗壞血酸，原標(biāo)準(zhǔn)名稱已不符合現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)2“本標(biāo)準(zhǔn)…”“本文件按照GB/T1.1-2020…--GB/T17816-2020要求重新3本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鄰苯二胺熒光法測定飼料中總本標(biāo)準(zhǔn)適用于單一飼料、配合飼料、預(yù)混料及濃縮飼料。不適用以酯化抗壞血酸形式添在最終提取液中抗壞血酸最小檢出限為0.022本文件規(guī)定了鄰苯二胺熒光法、高效液相色本文件第一法適用于單一飼料、配合飼料、預(yù)混料、濃縮飼料中抗壞血酸的測定。第二法適用于配合飼料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料、維生素預(yù)混合飼料中抗壞血酸的測本文件鄰苯二胺熒光法的檢出限為3mg/kg，定量限為10mg/kg；高效液相色譜法檢出限重新確定了熒根據(jù)新方法確定了其適用范4下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文,通過在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時,所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會被修訂,使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。GB/T6682-1992分析實驗室用水規(guī)下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本規(guī)定要求。增加試樣制備的5無一種具有抗氧化性質(zhì)的有機化合物，分D-異抗壞血酸D-Isoascorb具有強還原性，對機體基本無生物活L-脫氫抗壞血酸L-DehydroascorbL-抗壞血酸極易被氧化為L-脫氫抗壞血酸，L-脫氫抗壞血酸亦可被還原為L-抗壞血2020的規(guī)定補L-抗壞血酸總量TotalL-Asco將試樣中L-脫氫抗壞血酸還原成L-抗壞血酸或?qū)⒃嚇又蠰-抗壞血酸氧化成L-脫氫抗6X=……………（1）X——每千克試樣中含抗壞血酸及脫氫抗壞血C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的試樣液中抗壞血酸試樣中抗壞血酸的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω1表示，單位為毫克每千克（mg/kg），按公式ω1——試樣中抗壞血酸及脫氫抗壞血酸的總）；m1——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的試樣溶液中抗壞）；）；）；1——熒光反應(yīng)所用試樣體積，單位為毫升測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保使結(jié)果計算表7無增加飼料中抗壞血酸的高效反相色譜柱分離，其中L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸直接用配有紫外檢測器的液圖2L-脫氫抗壞血酸的還原原理圖將L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別配制成濃度為20μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用二極管矩陣檢測器在190～400nm波長范圍內(nèi)采集光譜圖，如圖3圖4。結(jié)果表明，L-抗壞血酸在263nm處有最大吸收，D-異抗壞血酸在圖3L-抗壞血酸紫外光譜掃描圖圖4D-異抗壞血酸紫外光譜掃描圖抗壞血酸的同分異構(gòu)體分為L-型和D-型，每種構(gòu)型均存在氧化和還原型形式。L-抗壞血酸作為維生素類營養(yǎng)強化劑廣泛應(yīng)用于飼料產(chǎn)品中。L-脫氫抗壞血酸的生理活性約為L-抗壞血酸的80%[4]。D-異抗壞血酸僅具有5%的維生素C原活性[5]，但其抗氧化性極佳，2018年農(nóng)業(yè)部將其作為抗氧化劑增補進(jìn)入《飼采用的熒光法只能測定飼料樣品中添加的抗壞血酸總量，無法區(qū)分L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸。為了同時測定并有效分離不同構(gòu)型的抗壞血酸，查閱文獻(xiàn)考察了0.05mol/L偏磷酸（HPO3）水溶液、0.1%甲酸（HCOOH）水溶液、0.1%磷酸（H3PO4）水溶液、0.05mol/L磷酸二氫鉀（KH2PO4）水溶液和6.8g磷酸二氫鉀和0.91g十六烷基三甲基溴化銨（KH2結(jié)果表明，以0.05mol/LHPO3水溶液為流動相時，L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸不能實現(xiàn)良好分離；以0.1%H3PO4水溶液為流動相時，D-異時，在目標(biāo)峰前有溶劑峰；而以KH2PO4+CTAB為流動相時，理論塔板數(shù)大于圖5L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同流動相下的色譜圖表3流動相對色譜分離的影響流動相種類L-抗壞血酸塔板數(shù)nD-異抗壞血酸塔板數(shù)n分離度RHPO31763617292HCOO25H3PO41859813271KH2PO418190206602.21KH2PO4+CTAB1301212833為了提高方法的選擇性，改善分離度，在流動相中引入甲醇并對其比例進(jìn)行優(yōu)化。以磷酸二氫鉀-十六烷基三甲基溴化銨為水相血酸和D-異抗壞血酸色譜峰的分離度最大，對稱性好，故流動相中甲醇的比例圖6L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同比例甲醇作為流動相下的色譜圖表4甲醇比例對色譜分離的影響L-抗壞血酸塔板數(shù)nD-異抗壞血酸塔板數(shù)n分離度R091532.1911085996112.822961381702.163977988082.65L-抗壞血酸具有酸性和還原性，其在干燥狀態(tài)下十分穩(wěn)定，但在溶液中不穩(wěn)定，受光、熱、氧化酶及銅、鐵離子會氧化分解，在中性或堿性溶液中易被破壞[6]。考察不同pH值對L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸色譜行為的影響。由圖7和表4可知，流動相的pH值對分離起到非常關(guān)鍵的作用。隨著pH值進(jìn)一步增大，兩者分離度增大，但峰形逐漸變寬，靈敏度降低。同時考慮到色譜柱使圖7L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同pH值的流動相下的色譜圖表5pH值對色譜分離的影響pH值L-抗壞血酸塔板數(shù)nD-異抗壞血酸塔板數(shù)n分離度R2.5017216175003.0016378162032.003.50120852.854.001068934692.79抗壞血酸分離效果的影響，結(jié)果見圖5和表5。結(jié)果表明，隨著流速的降低，分離度和理論塔板數(shù)逐漸增加，但保留時間也隨之延長，增加了時間成本，并且進(jìn)樣前，離子對試劑需要大量時間平衡，否則連續(xù)進(jìn)樣時會出現(xiàn)保留時間漂圖8L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同流速下的色譜圖表6流速對色譜分離的影響流速（mL/min）L-抗壞血酸塔板數(shù)nD-異抗壞血酸塔板數(shù)n分離度R0.715087149264.260.813820134253.770.913107122823.18130852.45L-抗壞血酸在在堿性條件下易分解，在酸性溶液中較為穩(wěn)定，XingnanLi[7]酸含量。JensLykkesfeldts[8]等發(fā)現(xiàn)當(dāng)以5%的偏磷酸為提取液時，加入還原劑三-(2-羧乙基)膦，能使L-抗壞血酸96h內(nèi)保持穩(wěn)定，不被氧化分解。曾雪儀[9]發(fā)現(xiàn)與0.1mol/L草酸、0.1%鹽酸、0.1mol/L磷酸相比，使用20g/L偏磷酸溶液提取粳米樣品時，具有較高的回收率。本實驗在綜合上述研究基礎(chǔ)上選擇偏的穩(wěn)定性的差異。結(jié)果表明，隨著偏磷酸濃度的增加，L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均峰面積有所降低，以20g/L偏磷酸溶液為提取液時，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏表7偏磷酸濃度對L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性的影響峰面積峰面積偏磷酸濃度（g/L）123平均值RSD（%）516.27916.02116.1880.8115.99615.3832.492016.00015.99715.8720.464015.62115.42515.5390.63生產(chǎn)廠家通常采取乙基纖維素作為包衣材料[10]，通過包衣工藝將L-抗壞血酸原料進(jìn)行包埋，從而隔斷其與外部環(huán)境的接觸，提升L-抗壞血酸的穩(wěn)定性。為了使L-抗壞血酸徹底溶出，選取配合飼料和預(yù)混料，加入一定含量的L-抗壞血酸稀釋劑，比較超聲提取、震蕩提取、超聲+震蕩提取三種方式影響。結(jié)果表明，以震蕩為提取方式時，L-抗壞血酸的回收率最低。以超聲、超聲+震蕩兩者為提取條件L-抗壞血酸的回收率經(jīng)檢驗統(tǒng)計分析，兩者在95%表8提取方式對回收率的影響提取方式樣品名稱回收率/%平均回收率/%RSD/%超聲配合飼料94.4792.2494.4193.7預(yù)混料98.58102.41震蕩配合飼料84.1386.8885.8985.6預(yù)混料104.2083.8697.4695.2超聲+震蕩配合飼料93.1994.3293.90.64預(yù)混料96.81103.2298.6899.63.31圖9提取方式對回收率的影響選取配合飼料和預(yù)混料，加入一定含量的L-抗壞血酸稀釋劑，研究不同提20min時，回收率最高，考慮到L-抗壞血酸水溶液性質(zhì)不穩(wěn)定，故超聲時間選表9提取時間對回收率的影響提取時間/min樣品名稱回收率/%平均回收率/%RSD/%5配合飼料91.4788.0588.3989.3預(yù)混料82.2294.0987.3087.96.78配合飼料94.4792.2494.4193.7預(yù)混料98.58102.4199.5420配合飼料92.9293.9492.0293.0預(yù)混料99.54101.0494.4598.33.5130配合飼料86.9285.5986.2486.30.77預(yù)混料85.6199.5991.87.77圖10提取時間對回收率的影響L-抗壞血酸易受光、熱、pH值等條件的影響氧化成L-脫氫抗壞血酸，如果L-脫氫抗壞血酸不還原回其抗壞血酸狀態(tài)，它將進(jìn)一步不可逆地氧化成2,3-二酮古洛糖酸[11]，將大大降低L-抗壞血酸活性。L-抗壞血酸在263nm處有最大紫外吸收，而L-脫氫抗壞血酸只能在210nm處檢測，紫外檢測器對其響應(yīng)能力和選擇性都較低，不利于定量分析，因此需要將L-脫氫抗壞血酸還原成L-抗壞血酸進(jìn)行檢測。含硫醇的化合物可以將脫氫型抗壞血酸穩(wěn)定地還原為還原型抗壞血酸。選用三-(2-羧乙基)膦、二硫蘇糖醇、L-半胱氨酸三種還原劑分別與L-脫氫抗壞血酸反應(yīng)。L-脫氫抗壞血酸轉(zhuǎn)化率見表9，結(jié)果表明，以L-半胱氨酸為還原劑時，L-脫氫抗壞血酸轉(zhuǎn)化率最佳，同時考慮到L-半胱氨酸價格便宜圖11L-抗壞血酸的降解途徑表10還原劑對還原率的影響還原劑種類還原率/%平均還原率/%RSD/%三-(2-羧乙基)膦97.2497.4696.4497.00.55二硫蘇糖醇89.3591.0893.8791.42.50L-半胱氨酸97.01100.2498.7398.7L-抗壞血酸-2-磷酸酯鹽是以L-抗壞血酸與偏磷酸鹽(鈉、鈣、鎂等)反應(yīng)所制得的。其既具有L-抗壞血酸所有功效，又克服了L-抗壞血酸怕光、熱及金屬離子等，易被氧化的缺點，因此也在飼料產(chǎn)品中應(yīng)用廣泛?？疾霯-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂鹽、L-脫氫抗壞血酸對本方法的兩種化合物測定的影響，將四種物質(zhì)配置成20μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述優(yōu)化后的實驗條件下的色譜圖見圖10。結(jié)果表明，L-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂鹽、出峰，表明這兩種物質(zhì)對L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的測定無干擾。L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸配制成1mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，2℃-8℃避結(jié)果表明，L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液七天內(nèi)測得的峰面積的RSD均小于5%。因此，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的儲備液（1mg/mL）在2℃-8℃表11標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果時間（天）0357RSD/%L-抗壞血酸平均峰面積D-異抗壞血酸平均峰面積12.354取L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，配制成質(zhì)量濃度分μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫表12L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)序號待測組分線性范圍(μg/mL）線性方程R21L-抗壞血酸0-50.0Y=0.5874X-0.10720.99992D-異抗壞血酸0-50.0Y=0.6593X-0.18720.9999述條件和方法，經(jīng)液相色譜儀測得信噪比（S/N）均大于3；添加標(biāo)準(zhǔn)溶液20最終確定本方法檢出限為5mg/kg，定量限為20mg/kg。配合飼料、濃縮料、預(yù)混合飼料樣品空白、定量限濃度添加樣品（20mg/kg）的色譜圖見圖13～圖圖13配合飼料樣品空白、定量限色譜圖圖14濃縮料樣品空白、定量限色譜圖圖15預(yù)混料樣品空白、定量限色譜圖本方法收集雞配合飼料、豬配合飼料、蝦料、魚料、濃縮飼料、蛙預(yù)混合分別添加低、中、高3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度平行測定6次，計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD測定結(jié)果見表12。結(jié)果表明采用液相色譜法測定L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸，在低、中、高三個添加水平下有良好的加標(biāo)表13飼料樣品的添加回收率和精密度料酸料酸糧酸料酸料酸料酸料酸料酸酸料酸料酸從市場采集奶牛濃縮飼料、水產(chǎn)配合飼料、兔配合飼料、豬復(fù)合預(yù)混合飼料、水產(chǎn)維生素預(yù)混合飼料等飼料產(chǎn)品，按照上述確定的條件和方法，測定實際樣品中L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的含量，結(jié)果見表13，可看出不同飼料產(chǎn)品L-抗壞血酸含量差別較大，且11種飼料產(chǎn)品均未檢出D-異抗壞血酸。結(jié)果表明，該方法適用于配合飼料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料和維生素預(yù)混合表14實際樣品中L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸含量的測定結(jié)果序號樣品名稱測定結(jié)果(mg/kg)L-抗壞血酸D-異抗壞血酸1雞配合飼料NDND2豬配合飼料NDND3成貓糧NDND4魚飼料NDND5蝦飼料NDND6奶牛濃縮料NDND7兔生長繁殖飼料52.5±2.86ND8牛蛙復(fù)合預(yù)混料203±1.30ND9豬復(fù)合預(yù)混料1214±0.45ND兔維生素預(yù)混料20414±0.56ND蛙維生素預(yù)混料15521±0.72ND采用酸性溶液提取后，用活性炭將還原型的L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸轉(zhuǎn)化成氧化型的L-脫氫抗壞血酸和D-脫氫抗壞血酸，然后與鄰苯二胺反應(yīng)生成有熒光的喹喔啉，其熒光強度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比。另外，圖16L-抗壞血酸的氧化原理圖1.0mL、1.5mL和2.0mL，按照原標(biāo)準(zhǔn)中的操作步驟，配制成L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以標(biāo)準(zhǔn)系列熒光值分別減去標(biāo)準(zhǔn)空白熒光值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)抗壞血酸含量(μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程、相關(guān)系數(shù)質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液所測得的熒光值接近。故接下來的實驗選表15L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸以及兩者混合標(biāo)液的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)ⅠⅡⅢⅠ酸Ⅰ列按照空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法評估檢出限。選取空白配合飼料，添加一定濃度的L-計算出檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（S按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算得L-抗壞血酸的檢出限表16空白樣品加標(biāo)測定結(jié)果分本方法收集奶牛濃縮料、兔生長繁殖飼料、牛蛙復(fù)合預(yù)混料3種飼料產(chǎn)品做L-抗壞血酸添加回收實驗，分別添加低、中、高3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度平行測定6次，計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD測定結(jié)果見表表17飼料樣品的添加回收率和精密度稱料料豬復(fù)合預(yù)混合飼料、水產(chǎn)維生素預(yù)混合飼料等飼料產(chǎn)品進(jìn)行檢測，與液相法檢測結(jié)果進(jìn)行對比，結(jié)果見表17。由表17可知，兩種檢測方法檢測兔維生素預(yù)混料的結(jié)果差異最小，RSD為0.30%，檢測兔生長繁殖飼料的結(jié)果差異最大，RSD為1.50%，結(jié)果符合GB/T表182種檢測方法檢測相同樣品的結(jié)果比較序號樣品名稱測定結(jié)果(mg/kg)熒光法液相法RSD（%）1雞配合飼料NDNDND2豬配合飼料NDNDND3成貓糧NDNDND4魚飼料NDNDND5蝦飼料NDNDND6奶牛濃縮料NDNDND7兔生長繁殖飼料51.452.58牛蛙復(fù)合預(yù)混料206.5203.49豬復(fù)合預(yù)混料0.58兔維生素預(yù)混料20500204140.30蛙維生素預(yù)混55表192種檢測方法比較t檢驗差值95%置信區(qū)間t值p值鄰苯二胺熒光法-高效液相色譜法下限上限-6.52595.10290.085三、試驗驗證的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效料中總抗壞血酸的測定領(lǐng)苯二胺熒光法》的基礎(chǔ)上補充液相法，考察抗壞血酸驗證結(jié)果良好，能滿足配合飼料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料、維生素預(yù)混合四、與國際、國外同類標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容的對比情況，或者與測試的本標(biāo)準(zhǔn)在制定過程中，起草組收集了國內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，GB5009.86－2016抗壞血酸（維生素C）》,結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料，進(jìn)行分析和總結(jié)，通過實本標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中嚴(yán)格貫徹國家有關(guān)方針、政策、法律和規(guī)章等、嚴(yán)格執(zhí)行國家強制性標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。與相關(guān)的各種基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)相銜接，遵循了政策性和協(xié)調(diào)同一性的原則。本標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章和政策以及有關(guān)基礎(chǔ)本標(biāo)準(zhǔn)未明確涉及某一具體專利，但某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)九、貫徹國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，以及組織措施、技術(shù)措施、過渡期和（1）首先應(yīng)在實施前保證文本的充足供應(yīng)，讓每個使用者都能及時得到文（2）發(fā)布后、實施前應(yīng)將信息在媒體上廣為宣傳，建議全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會組織標(biāo)準(zhǔn)起草單位通過標(biāo)準(zhǔn)培訓(xùn)、會議宣貫、影音文件等方式，[1]王建翠.HPLC測定蜂花粉中的總抗壞血酸和黃曲霉毒素[D].福建農(nóng)林大學(xué),2013.[2]抗壞血酸在雞飼料中的應(yīng)用[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,1995,(02):44-45.[3]FenollJ,MartínezA,HellínP,etal.Simultaneousdeterminationofascorbic