DB12T 527-2014 奶牛結(jié)核病凈化技術(shù)規(guī)范

DB12DB12/T527—2014奶牛結(jié)核病凈化技術(shù)規(guī)范ThetechnicalstandardforcleaningofBovineTuberculosisindairycattle天津市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布I1牛結(jié)核病BovineTubercu24檢測方法4.1牛型結(jié)核分枝桿菌PPD（提純蛋白衍生物）皮內(nèi)4.2γ-干擾素ELISA試驗(yàn)作為牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)5.1.4檢測時(shí)，首先用牛型結(jié)核分枝桿菌試驗(yàn)檢測，如γ-干擾素ELISA試驗(yàn)牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)和γ-干擾素反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果陽性或可疑牛須與受威脅的5.3.1撲殺對(duì)確認(rèn)的結(jié)核病陽性牛5.4.1緊急消毒奶牛群中檢出并剔出結(jié)核病陽性牛后，對(duì)污染的場所、用具、物品進(jìn)行嚴(yán)格消毒。飼養(yǎng)場的金屬設(shè)施、設(shè)備采取火焰、熏蒸等方式消毒；飼進(jìn)行一次大消毒，分娩室在臨產(chǎn)牛生產(chǎn)前及分娩后各35.5.1異地調(diào)運(yùn)的奶牛，必須來自于非疫區(qū)，應(yīng)當(dāng)符合農(nóng)業(yè)部物檢疫管理辦法》相關(guān)規(guī)定隔離飼養(yǎng)30從事奶牛飼養(yǎng)和管理的人員每年要進(jìn)行健康檢查，發(fā)現(xiàn)患有6凈化群（場）的認(rèn)定7凈化群（場）的維持7.2發(fā)現(xiàn)陽性牛按照本規(guī)范5.3規(guī)定處理，同群牛按本規(guī)范5.1.2要求檢測。4γ-干擾素ELISA試驗(yàn)A.1.1牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素ELISA試劑盒（內(nèi)含酶標(biāo)板、牛γ-干擾素陽性對(duì)照、牛γ-干擾素陰A.1.2牛型提純結(jié)核菌素（牛型PPA.1.4肝素鈉真空管A.1.5孔組織培養(yǎng)板A.1.6單道可調(diào)移液器及配套吸頭（20μL-200μL、100μL-1000μL、1mL-A.1.7道移液器及配套吸頭（50μL-300μL）A.1.9有蓋離心管（1.5A.1.10恒溫CO2培養(yǎng)箱A.1.12洗板機(jī)A.2.3酶標(biāo)結(jié)合物稀釋液用去離子水或蒸餾水重新溶解5倍濃縮的酶標(biāo)結(jié)合物稀A.2.4牛γ-干擾素陽性對(duì)照用1mL去離子水A.2.5牛γ-干擾素陰性對(duì)照用1mL去離子水A.2.6洗液用去離子水或蒸餾水重新溶解20倍濃縮的洗A.2.7顯色劑溶液將100倍濃縮的顯色劑溶液用底物緩沖液做100倍稀釋配A.3.1臨床樣本采集及預(yù)處理A.3.1.1樣本的采集牛靜脈無菌采血5mL，放入肝素鈉血后8h（最長不超過30h）內(nèi)用于檢測。A.3.1.4加入牛型PPD、禽型PPD和PBS向24孔培養(yǎng)板中每份樣品對(duì)應(yīng)的3個(gè)孔分別無菌加入100A.3.1.5全血孵育過夜將全血培養(yǎng)板置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃孵育18h（全血可接受培養(yǎng)時(shí)間為16~5A.3.1.6收獲血漿經(jīng)過18h培養(yǎng)，用移液器A.3.2檢測方法A.3.2.1試驗(yàn)前將酶標(biāo)板和所有試劑恢復(fù)到室溫，試劑充分混勻。A.3.2.2向酶標(biāo)板中的96孔中分別加入50μL血漿稀釋緩沖液，再向相應(yīng)孔中加入50μL待測樣品和牛γ-干擾素陰、陽性對(duì)照樣品。對(duì)照樣品應(yīng)最后加入。充分振蕩1min，徹底混勻。封板，±5）℃]孵育60±5）min］。用洗板機(jī)洗滌6次，將酶標(biāo)板放在干凈的濾紙上拍A.3.2.3每孔加入100μL稀釋好的酶標(biāo)結(jié)合物，充分振蕩混勻。室溫孵育（60±5min洗滌6次。A.3.2.4每孔加入100μL新鮮配制的顯色劑溶液，充分振蕩混合。室溫避光孵育30min。A.3.2.5迅速加入50μL終止液，輕輕搖動(dòng)混勻。A.3.2.6終止后5min內(nèi)讀出OD450值，然后用OD450值計(jì)算結(jié)果。A.3.3.1滿足以下2個(gè)條件試驗(yàn)方成立牛γ-干擾素陰性對(duì)照OD450值<0.13，且陰性對(duì)照重復(fù)孔OD450值差≤0.04；牛γ-干擾素陽性對(duì)照OD450值>0.7。A.3.3.2計(jì)算每頭動(dòng)物所有樣品（包括加入牛型PPD、禽型PPD和PBS）的OD450值陽性=牛型PPD的OD450值-禽型PPD的OD450值≥0.1，且牛型PPD的OD450值-P