《卷煙 側(cè)流煙氣中苯并a芘的測定 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法》試驗(yàn)報(bào)告

PAGEPAGE4《卷煙側(cè)流煙氣中苯并[a]芘的測定氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法》研究報(bào)告鄭州煙草研究院湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司2010年6月卷煙側(cè)流煙氣中苯并[a]芘的測定氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法研究報(bào)告1概述稠環(huán)芳烴（PolycylicAromaticHydrocarbons，簡稱PAHs）廣泛存在于土壤、大氣、植物體、食品、污水、汽車尾氣以及卷煙煙氣中【1】。卷煙煙氣中已分離鑒定出幾百種稠環(huán)芳烴，這些稠環(huán)芳烴是由萜烯、植物甾醇（如豆甾醇）、蠟、糖、氨基酸、纖維素等組分通過熱裂解和高溫?zé)岷铣?，以及各種初級(jí)烴通過自由基反應(yīng)形成的。卷煙燃燒過程中，溫度高于800℃時(shí)生成稠環(huán)芳烴［2］。多數(shù)稠環(huán)芳烴都具有較強(qiáng)的毒性和致癌作用［3-6］，苯并［a］芘（BaP）的致癌作用明顯高于其它稠環(huán)芳烴［7-9］，因而BaP成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。推測的苯并[a]芘的形成路徑見圖圖1.1推測的苯并[a]芘的形成路徑近年來對(duì)稠環(huán)芳烴的研究受到越來越多的關(guān)注，有證據(jù)表明多數(shù)稠環(huán)芳烴具有較強(qiáng)的毒性和致癌作用。表1.1列出了由國際癌癥研究中心(IARC)對(duì)部分稠環(huán)芳烴類物質(zhì)進(jìn)行動(dòng)物和人類致癌試驗(yàn)的評(píng)價(jià)結(jié)果。表1.2列出了由美國環(huán)保總署所做的稠環(huán)芳烴毒性比較結(jié)果。表1.1稠環(huán)芳烴致癌試驗(yàn)評(píng)價(jià)化合物實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物人體Benz(a)anthracene完全致癌未做評(píng)價(jià)Benzo(b)fluoranthene完全致癌未做評(píng)價(jià)Benzo(j)fluoranthene完全致癌未做評(píng)價(jià)Benzo(k)fluoranthene完全致癌未做評(píng)價(jià)Benzo(a)pyrene完全致癌可能致癌Chrysene完全致癌未做評(píng)價(jià)Dibenz(a,h)anthracene完全致癌未做評(píng)價(jià)Dibenzo(a,i)pyrene完全致癌未做評(píng)價(jià)Dibenzo(a,l)pyrene完全致癌未做評(píng)價(jià)Indeno(1,2,3-c,d)pyrene完全致癌未做評(píng)價(jià)5-Methylchrysene完全致癌未做評(píng)價(jià)表1.2稠環(huán)芳烴毒害性比較化合物ToxicityEquivalencyFactor(TEF)Benzo(a)pyrene1Benz(a)anthracene0.1Benzo(b)fluoranthene0.1Benzo(k)fluoranthene0.1Indeno(1,2,3-c,d)pyrene0.1Anthracene0.01Benzo[g,h,I,]perylene0.01Chrysene0.01Acenaphthene0.001Acenaphthylene0.001Fluoranthene0.001Fluorene0.001在所有的稠環(huán)芳烴中，苯并[a]芘是最具代表性的一種，其分子結(jié)構(gòu)見圖1.2所示。苯并[a]芘的致癌作用明顯高于其它稠環(huán)芳烴，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。圖1.2苯并[a]芘分子結(jié)構(gòu)苯并[a]芘的代謝過程見圖1.3。苯并[a]芘經(jīng)微粒體單氧酶系氧化成7,8-環(huán)氧化物，再水解成相應(yīng)的7,8-二氫二醇，并進(jìn)一步生成7,8-二氫二醇-9,10-環(huán)氧化物。有實(shí)驗(yàn)證明苯并[a]芘在體內(nèi)與DNA的結(jié)合產(chǎn)物正是由相應(yīng)的7,8-二氫二醇環(huán)氧化物生成的。圖1.3苯并[a]芘的代謝過程卷煙主流煙氣中苯并[a]芘的分析測定工作開展較早，由于苯并[a]芘的沸點(diǎn)較高，再加上早期氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不夠完善，苯并[a]芘的分析測定主要采用高效液相色譜[10－14]。1974年O'HARA等人[10]采用高效液相色譜法測定了卷煙煙氣冷凝物中的苯并[a]芘，后來的研究中主要對(duì)苯并[a]芘的分離除雜方法和檢測條件進(jìn)行了改進(jìn)。在測定卷煙煙氣中苯并[a]芘的方法中主要采取半制備HPLC或固相萃?。⊿PE）作為預(yù)處理方法，前者可以獲得較高的回收率和較好的準(zhǔn)確度，但操作較為繁瑣，后者方法較為簡便、迅速，費(fèi)用也較為低廉，但回收率和去除干擾的能力較差。苯并[a]芘的檢測方法以熒光檢測是最為理想的方法，具有很高的靈敏度和選擇性，謝復(fù)煒等人[15]在2001年Coresta會(huì)議上發(fā)布了卷煙主流煙氣和側(cè)流煙氣中苯并[a]芘的測定方法。該方法采用一種改進(jìn)的SPE方法對(duì)苯并[a]芘進(jìn)行前處理，在簡便，快速的同時(shí)，提高了回收率和選擇性，在檢測器方面采用較為常見的紫外檢測器，也取得了較好的結(jié)果。隨著氣質(zhì)聯(lián)用儀器的發(fā)展，2004年，夏巧玲[16]建立了2種測定卷煙煙氣中苯并[a]芘的方法——高效液相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法，結(jié)果表明：用HPLC和GC/MS方法分析卷煙煙氣中的苯并[a]芘都可以取得較好的結(jié)果，但由于GC/MS法采用選擇離子檢測苯并[a]芘，簡化了前處理過程，苯并[a]芘的回收率和檢測的靈敏度均較HPLC法高。加拿大健康署頒布的側(cè)流煙氣苯并[a]芘方法[17]采用高效液相方法，該方法用丙酮淋洗魚尾罩，丙酮萃取玻璃纖維濾片中的苯并[a]芘，然后取萃取液用N2吹干，加入環(huán)己烷復(fù)溶，溶液經(jīng)氨基硅膠柱凈化，淋洗液為正己烷，收集到的溶液揮發(fā)干后加入乙腈復(fù)溶進(jìn)HPLC分析。隨著側(cè)流煙氣捕集裝置的發(fā)展，魚尾罩吸收裝置因易與吸煙機(jī)連接且不影響卷煙的燃燒過程，從而成為CORESTA推薦的卷煙側(cè)流煙氣收集裝置。2001年謝復(fù)煒等人[15]用魚尾罩收集卷煙側(cè)流煙氣，用高效液相色譜－紫外檢測器進(jìn)行了定量分析。煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T185-2004“卷煙側(cè)流煙氣中焦油和煙堿的測定”[18]和謝復(fù)煒等人[19]測定卷煙側(cè)流煙氣中的酚類化合物也采用了魚尾罩作為捕集側(cè)流煙氣的方法。目前國內(nèi)針對(duì)環(huán)境空氣、固定污染源排氣和食品中苯并[a]芘的測定標(biāo)準(zhǔn)方法[20-22]已經(jīng)建立，對(duì)食品、室內(nèi)空氣和居住區(qū)大氣中的苯并[a]芘限量標(biāo)準(zhǔn)[23-25]也分別在1994、1999、2000年相繼發(fā)布。卷煙主流煙氣中苯并[a]芘的測定標(biāo)準(zhǔn)方法[26]在2007年發(fā)布，而卷煙側(cè)流煙氣中苯并[a]芘的測定方法目前還沒有建立標(biāo)準(zhǔn)。2實(shí)驗(yàn)2.1儀器和試劑CeruleanSM405-SV型側(cè)流吸煙機(jī)；Agilent6890－5973氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀；BuchiR-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。彈性石英毛細(xì)管色譜柱：DB-5MS30m×0.25mm×0.25μm。甲醇、丙酮、環(huán)己烷，(均為色譜純)；苯并[a]芘（標(biāo)樣，F(xiàn)luka）；D12-苯并[a]芘（標(biāo)樣，F(xiàn)luka）；具塞三角燒瓶，濃縮瓶，硅膠固相萃取柱。樣品卷煙A（烤煙型，卷煙危害性評(píng)價(jià)參比卷煙，焦油12mg）；樣品卷煙B（混合型，卷煙危害性評(píng)價(jià)參比卷煙，焦油8mg）；樣品卷煙C（烤煙型，國產(chǎn)某品牌，焦油13mg）；樣品卷煙D（烤煙型，國產(chǎn)某品牌，焦油8mg）。2.2側(cè)流煙氣總粒相物的收集和預(yù)處理所用卷煙實(shí)驗(yàn)前在(22±1)℃、相對(duì)濕度(60±2)%條件下平衡48h，然后經(jīng)重量及吸阻分選，挑出均勻一致的試驗(yàn)煙支。用SM405-SV型側(cè)流吸煙機(jī)抽吸卷煙，具體方法參考YC/T185-2004[18]。每張玻璃纖維濾片收集3支卷煙側(cè)流煙氣。取下魚尾罩，取20mL甲醇，用滴管吸取對(duì)魚尾罩進(jìn)行清洗。用100mL三角瓶收集甲醇溶液。收集到的甲醇溶液在抽真空條件下（55°C,300mbar），濃縮干。將玻璃纖維濾片（含3支煙側(cè)流粒相物）放入三角瓶內(nèi)，加入10μL0.2mg/mL的D12-苯并[a]芘內(nèi)標(biāo)溶液，20mL環(huán)己烷，超聲萃取40min。提取溶液直接用GC/MS分析。2.3GC/MS分析色譜柱DB-5MS柱，30m×0.25mm×0.25μm進(jìn)樣口溫度：280°C進(jìn)樣量：1μL，不分流進(jìn)樣。載氣：1.2mL/min，恒流模式。程序升溫：始溫150°C，以6°C/min升高到260°C，再以2質(zhì)譜條件：傳輸線溫度280°C結(jié)果與討論魚尾罩清洗試劑及用量的選擇分別選擇環(huán)己烷、丙酮和甲醇作為魚尾罩淋洗試劑，測定洗脫效率和重復(fù)性。結(jié)果顯示（表3.1）：用甲醇作清洗溶劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性和洗脫量較高，丙酮和環(huán)己烷效果較差。從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可以看出，甲醇可以將魚尾罩上的煙氣凝聚物完全清洗下來，而用丙酮和環(huán)己烷為淋洗試劑時(shí)，大部分煙氣凝聚物仍留在魚尾罩上。將丙酮和環(huán)己烷用量增大到80mL淋洗魚尾罩，然后再用甲醇淋洗魚尾罩，檢測甲醇溶液，仍然能夠檢測到苯并[a]芘，說明丙酮和環(huán)己烷無法完全洗脫出苯并[a]芘，所以最終選擇甲醇作為魚尾罩的淋洗試劑。從表3.1中看出魚尾罩中苯并[a]芘量為2ng/cig左右，與卷煙結(jié)果（表3.4）相比，約占1.7％左右，說明側(cè)流煙氣苯并[a]芘大部分由玻璃纖維濾片捕集。表3.1 魚尾罩清洗試劑及用量的選擇（淋洗試劑用量30mL）淋洗試劑試驗(yàn)1（ng/cig）試驗(yàn)2（ng/cig）試驗(yàn)3（ng/cig）丙酮1.82.12.1環(huán)己烷2.21.42.1甲醇2.62.52.5表3.2甲醇淋洗試劑的用量選擇淋洗試劑用量10mL20mL30mL苯并[a]芘（ng/cig）2.30.095Nd甲醇用量考察：用30mL甲醇清洗魚尾罩，以10mL為一集份，分別檢測其中苯并[a]芘的含量（表3.2），第一、二集份分別為2.3，0.095ng/cig，第三集份未檢出。因此選擇淋洗試劑20mL。濾片前處理方法在GB/T21130-2007的煙氣總粒相物中苯并[a]芘的測定中 ，濾片用環(huán)己烷萃取后，過硅膠固相萃取柱凈化，并濃縮后進(jìn)樣分析。考慮到卷煙測流煙氣中BaP含量較高，為了降低前處理的復(fù)雜程度，本方法采取萃取液直接進(jìn)樣的方法，從圖3.1看出，內(nèi)標(biāo)峰和BaP峰信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于定量限，說明樣品不經(jīng)過濃縮可以滿足分析要求。由于本方法沒有采取硅膠固相萃取柱凈化萃取液，樣品雜質(zhì)較多，可能會(huì)污染氣相色譜和質(zhì)譜檢測器而影響樣品的分析效果，因此采取連續(xù)進(jìn)不同樣品的方法考察本方法對(duì)儀器的響應(yīng)影響，經(jīng)過50次進(jìn)樣后和第一次進(jìn)樣相比（圖3.2），可以看出，經(jīng)過50次進(jìn)樣后樣品內(nèi)標(biāo)和BaP峰的保留時(shí)間沒有改變，信噪比也沒有變化，說明萃取液不經(jīng)凈化不會(huì)影響儀器的響應(yīng)。圖3.1典型樣品萃取離子流圖圖3.2連續(xù)進(jìn)樣對(duì)儀器響應(yīng)影響分析方法評(píng)價(jià)方法回收率魚尾罩回收率考慮到魚尾罩上樣品量低，且變異系數(shù)較大。采用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行濃縮步驟的回收率測定。取1mL一定濃度的BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入20mL甲醇，抽真空條件下（55°C,300mbar），濃縮干。加入內(nèi)標(biāo)測定和1mL環(huán)己烷復(fù)溶。測定回收率。實(shí)際得到回收率為97.1%。表明將魚尾罩清洗溶液濃縮干，其中玻璃纖維濾片回收率表3.3方法回收率加入水平（ng/cig）檢出量（ng/cig）回收率（ng/cig）54.052.296.6%81.074.692.0%235.1239.6101.9%采用加標(biāo)回收率的方法測定本方法的回收率，分別加入54.0、81.0和235.1ng/cig，方法回收率在92.0-101.9%之間，說明本方法的準(zhǔn)確性較高。3.3.2方法精密度：實(shí)驗(yàn)考察了本方法的日內(nèi)日間精密度。結(jié)果如下表所示：表3.4方法的精密度試驗(yàn)測定次數(shù)日內(nèi)檢測（ng/cig）日間檢測（ng/cig）1115.7127.22119.8125.33119.6118.94123.0124.05125.1118.2平均值120.6122.8SD3.593.99RSD2.97%3.25%可以看出，本方法對(duì)卷煙樣品的測試精密度較好。3.3.4工作曲線及檢測限取10mgD12-苯并[a]芘,用環(huán)己烷定容到50mL，得到濃度為0.2mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。稱取10mg苯并[a]芘，用環(huán)己烷定容到100mL，得到濃度為0.1mg/mL苯并[a]芘儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取1.00mL苯并[a]芘儲(chǔ)備溶液至100mL容量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，得到一級(jí)苯并[a]芘溶液。分別取一級(jí)苯并[a]芘溶液0.5mL,1mL,2mL,5mL,8mL和一級(jí)內(nèi)標(biāo)溶液50μL,用環(huán)己烷定容到100mL容量瓶中，得到濃度分別是5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)濃度為100ng/mL。將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行GC/MS分析，得到苯并[a]芘和內(nèi)標(biāo)的積分峰面積，用苯并[a]芘與內(nèi)標(biāo)峰濃度比值作為橫坐標(biāo)，用苯并[a]芘與內(nèi)標(biāo)峰面積比值作為縱坐標(biāo)，建立苯并[a]芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3.3）。由此看出，在5-80ng/mL濃度范圍內(nèi)，苯并[a]芘相應(yīng)值與其濃度有很好的線性關(guān)系。表3.5方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限①和定量限②標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)檢測限（ng/cig）檢測限（ng/mL）定量限（ng/cig）定量限（ng/mL）Y=1.114x-0.00930.99991.60.255.40.82注：①以最低濃度標(biāo)樣重復(fù)10次測試標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍計(jì)算；②以最低濃度標(biāo)樣重復(fù)10次測試標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍計(jì)算圖3.3苯并[a]芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線3.3.5不同實(shí)驗(yàn)室之間實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較為了驗(yàn)證本方法在不同實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用情況，本項(xiàng)目組織了7家實(shí)驗(yàn)室采用該方法對(duì)四個(gè)不同類型的樣品卷煙進(jìn)行了分析測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3.6。表3.6不同實(shí)驗(yàn)室之間側(cè)流煙氣苯并[a]芘測定結(jié)果比較（ng/cig）實(shí)驗(yàn)室編號(hào)A卷煙B卷煙C卷煙D卷煙1＃平均值（ng/cig）124.0132.5119.0145.6rsd（％）4.84.45.74.62＃平均值（ng/cig）123.6130.6119.3138.6rsd（％）5.46.56.81.83＃平均值（ng/cig）127.2139.8121.2148.9rsd（％）3.33.12.83.64＃平均值（ng/cig）128.2146.1117.5156.3rsd（％）3.62.93.93.15＃平均值（ng/cig）123.2128.3125.3141.6rsd（％）1.84.21.44.76＃平均值（ng/cig）120.0127.7116.5129.8rsd（％）2.02.41.43.87＃平均值（ng/cig）143.5134.5130.3131.2rsd（％）1.31.10.80.8匯總統(tǒng)計(jì)總平均值（ng/cig）127.1134.2121.3141.7各實(shí)驗(yàn)室平均值RSD（％）6.15.04.16.7實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法，不同實(shí)驗(yàn)室得到了較為一致的分析結(jié)果，對(duì)不同類型卷煙同樣有良好的測試效果。4結(jié)論本項(xiàng)目提出了一套規(guī)范準(zhǔn)確的卷煙側(cè)流煙氣中苯并[a]芘的分析方法，該方法設(shè)計(jì)合理、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、準(zhǔn)確性和精確性高，可操作性強(qiáng)，易于推廣。參考文獻(xiàn)：HarrisonRM,PerryR,WellingsRA.Polynucleararomatichydro-carbonsinraw,potableandwastewaters[J].Wat.Res.,1975,9:331-346.RichardRBaker.煙氣化學(xué)[A].云南煙草科學(xué)研究院輔料項(xiàng)目組編譯.卷煙輔料研究[M].昆明：云南科技出版社，2001.386-482.AlanRodgmanMA.TheN-NitrosoaminesinTobaccoandTobaccoSmoke[R].R.J.ReynoldsTobaccoCompany,1993.HoffmannD,HechtSS.煙草致癌物研究進(jìn)展[R].AmercianHealthFoundation,Valhalla,IARCMonographs,WorldHealthOrganization.Evaluationofcarcinogenicnitroaminesinternationalagencyforresearchoncancer[R].Lyon,Toxicologicalprofileforpolycyclicaromatichydrocarbon[R].U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,1995.Alsberg,Westerholm,Chemicalandbiologicalcharacterizationoforganicmaterialfromgasolineexhaustparticles[J].Envir.Sci.Technol.,1985,19:43-50.TobaccoCarcinogenesis,PolycyclicHydrocarbonsandCancer(Vol.1)[M].NewYork:AcademicPress,1978.119-130.趙振華.多環(huán)芳烴的環(huán)境健康化學(xué)[M].北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1993.O'HARAJR.Determinationofbenzo[a]pyreneinsmokecondensatesbyhighpressurerapidliquidliquidchromatography[J].JFoodSci,1974,39(1):38-41.RISNERCH.Thedeterminationofbenzo[a]pyreneandbenz[a]anthraceneinmainstreamandsidestreamsmokeoftheKentuckyreferencecigarette1R4Fandacigarettewhichheatsbutdoesnotburntobacco:Acomparison[J].TobAbs,1992,4:621.DUMONTJ.Alternativeisolationprocedureforthesubsequentdeterminationofbenzo[a]pyreneintotalparticulatematterofcigarettesmoke[J].JChromatogrSci,1993,31(9):371-374.MARINERDC.Benzo(a)pyreneanalysis