金納米棒的制備和應(yīng)用

金納米棒的制備和應(yīng)用金納米棒的制備及其在生命科學(xué)上的應(yīng)用第一章研究背景金屬納米微粒的研究，尤其是對其形貌可控制備及其相關(guān)應(yīng)用的性質(zhì)和應(yīng)用研究一直是材料科學(xué)以及相關(guān)領(lǐng)域的前沿?zé)狳c。非球形的金納米顆粒如棒、線、管及核殼結(jié)構(gòu)相繼被成功合成，其各種性質(zhì)不僅僅依賴于尺寸而且還依賴于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其中金納米棒（goldnanorods，GNRs）是最受關(guān)注的一類。金納米棒是一種尺度從幾納米到上百納米的棒狀金納米顆粒。金是一種貴金屬材料，化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，金納米顆粒沿襲了其體相材料的這個性質(zhì)，因此具有相對穩(wěn)定，卻非常豐富的化學(xué)物理性質(zhì)。金納米棒擁有隨長寬比變化，從可見到近紅外連續(xù)可調(diào)的表面等離子體共振波長，極高的表面電場強度增強效應(yīng)（高至107倍），極大的光學(xué)吸收、散射截面，以及從50%到100%連續(xù)可調(diào)的光熱轉(zhuǎn)換效率。由于它獨特的光學(xué)、光電、光熱、光化學(xué)、以及分子生物學(xué)性質(zhì)，金納米棒在材料科學(xué)界正受到強烈的關(guān)注，并引發(fā)眾多材料學(xué)家、生物化學(xué)家、醫(yī)學(xué)家、物理學(xué)家、微電子工程師等科研工作者對之進(jìn)行廣泛和深入的研究。第二章GNRs的制備及修飾2.1GNRs的制備近年來，對于金納米棒的合成已經(jīng)研究出來許多有效的方法。主要分為晶種生長法，模板法，電化學(xué)法和光化學(xué)法等不同方法制備出分散性好顆粒均勻的金納米棒。2.1.1晶種法晶種法研究的時間最長，因此研究的最深入。晶種可以是球型金納米粒子，或者是短的金納米棒。晶種法合成金納米棒可以分為三個步驟：晶種的制備、生長液的配置、金納米棒的生成。1種子制備：將5mL0.50mM氯金酸（HAuCl4)溶液與5mL0.2M十六烷基溴化銨（CTAB）混合，加入0.6mL冰凍的0.01M硼氫化鈉（NaBH4）溶液，攪拌2min后25℃靜置2h。2生長溶液制備：向反應(yīng)容器中依次加入5mL0.20MCTAB，5mL1mMHAuCl4，0.5mL硝酸銀（AgNO3），0.07mL0.10M抗壞血酸（AA），攪拌2min。3GNRs制備：在生長溶液中加入0.012mL種子溶液,攪拌2min后28℃，靜置3h，得到充分生長的GNRs。在生長過程中納米棒的縱橫比可以通過改變晶種與金屬鹽的比例進(jìn)行控制。在隨后的研究中,通過調(diào)節(jié)溶液的pH也可改善納米棒的合成。對于長的金納米棒的制備，側(cè)需使生長液中同時存在一定比例的CTAB與BDAC。另外通過控制CTAB濃度，也能進(jìn)一步還原并獲得高縱橫比的金納米棒。而DanielleK.Smith等報道應(yīng)用不同廠家生產(chǎn)的CTAB都會對金納米棒的制備產(chǎn)生影響。一定范圍內(nèi)Ag+的加入量能控制金納米棒的縱橫比，提高金納米棒的產(chǎn)率。這種方法設(shè)備要求低，制備過程簡單，改變反應(yīng)物濃度就可改變縱橫比，使用最廣泛。2.1.2模板法模板法是指用孔徑為納米級到微米級的多孔材料作為模板，使前驅(qū)體進(jìn)入后在模板的孔壁上反應(yīng)，結(jié)合電化學(xué)沉淀法、溶膠凝膠法和氣相沉淀法等技術(shù)，形成所需的納米棒。模板法具有良好的可控制性：通過對模板尺寸的控制，可以制備出粒徑分布范圍窄、粒徑可控、反應(yīng)易于控制等貴金屬納米顆粒。Martin等最早利用模板法制備金納米棒，利用金納米棒的生長空間受限的原理，來合成金納米棒。vanderZande等發(fā)展了該方法，利用電化學(xué)沉積法將金沉積在納米多孔聚碳酸酯或氧化鋁模板內(nèi)，先噴上少量的導(dǎo)電基底，再電沉積金，隨后去除模板，加入PVP以保護(hù)和分散金納米棒，具體的制備流程如圖1所示。邵桂妮等利用HAuCl4以檸檬酸三鈉為還原劑，利用在多孔氧化鋁(AAO)模板中浸泡金溶膠，制備出一維金納米材料?？傮w來說，模板法的優(yōu)點在于通過控制模板孔道的長度、直徑以及電沉積時間可以有效的控制金納米棒的長徑比，但該方法最大的缺點在于生成金納米棒的產(chǎn)率比較低，制備過程復(fù)雜，產(chǎn)物難以控制。圖1(a)和(b)氧化鋁膜的掃描電鏡圖；(c)模板法制備金納米棒的流程圖；(d)模板法制備金納米棒的不同形貌TEM圖2.2GNRs的表面修飾晶種法合成金納米棒過程中使用大量的表面活性劑，十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），且CTAB分子在金納米棒表面吸附，生物分子很難與金納米棒偶聯(lián)，從而限制了在生物分析中的應(yīng)用，但是將大量的CTAB去除，又會導(dǎo)致金納米棒由于缺少了顆粒之間相互排斥力而發(fā)生不可逆的聚集，這種聚集現(xiàn)象對許多應(yīng)用是極為不利的；另外，金納米棒溶液中有力的大量CTAB分子對蛋白分子有毒性，使用中需要適量去除在合成金納米棒過程中大量的CTAB。2.2.1GNRs的m-SH-PEG表面修飾在去除GNRs溶液中CTAB的同時，為便于其體內(nèi)應(yīng)用，還需要對金納米棒進(jìn)行修飾以進(jìn)一步提升金納米棒的生物相容性。在研究中，我們首先利用具有良好生物相容性的m-SH-PEG對所合成的金納米棒進(jìn)行了初步的修飾，并測量和比較了兩者的Zeta電位由于陽離子表面活性劑CTAB的存在，金納米顆粒表面被陽離子包圍，其Zeta電位顯示為(28.47±1.15)mV相比之下，m-SH-PEG修飾后的金納米顆粒的Zeta電位大大降低，說明每個金納米棒上耦聯(lián)的帶正電荷的分子數(shù)目大大減少這一結(jié)果表明金納米顆粒表面上絕大部分CTAB已經(jīng)被m-SH-PEG所取代(表1)。表1m-SH-PEG修飾前后金納米棒的Zeta電位值2.2.2GNRs@mSiO2的制備各向異性金納米粒子的很多重要應(yīng)用都需要將顆粒組裝到表面，因此顆粒表面化學(xué)修飾是其中的關(guān)鍵。利用表面化學(xué)實驗方法，不僅可以有效的保護(hù)金納米棒避免聚集，而且使它們更適于組裝。常做的處理是在金納米顆粒表面包覆二氧化硅外殼。將制備所得的GNRs用Milli-Q去離子水清洗兩遍，離心去除過量的CTAB后重新分散在40mL去離子水中。然后加入50uL氨水(25%，wt%)將GNRs水溶液調(diào)至pH10.0左右,再以3.5mLh-1速度滴加入10.5mL10mMTEOS/乙醇溶液。40℃條件下溫和攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)產(chǎn)物分別用乙醇和水離心清洗數(shù)遍。為了更好去除介孔孔道內(nèi)的CTAB殘留分子，采用離子交換法，加入60mL乙醇/硝酸銨溶液(10mgmL-1)回流6h,然后再用乙醇溶液離心清洗。最后獲得的GNRs@mSiO2產(chǎn)物分散于去離子水中保存。第三章在生命科學(xué)上的應(yīng)用3.1醫(yī)學(xué)成像隨著科技發(fā)展、社會的進(jìn)步，疾病診斷和治療的非侵入式思想逐漸占主導(dǎo)。而在非侵入式的診斷和治療領(lǐng)域中，活體生物組織的實時成像是人們一直追求的目標(biāo)。但熒光成像技術(shù)面臨著兩個難題：（1）細(xì)胞在可見光區(qū)的自發(fā)熒光對標(biāo)記分子所發(fā)信號的掩蓋；（2）對所研究分子很難進(jìn)行長期熒光標(biāo)記觀察。這就迫切需要研制開發(fā)光穩(wěn)定性好的近紅外熒光探針。采用雙光子激發(fā)有以下優(yōu)點：1）由于用近紅外光激發(fā)，對活細(xì)胞的損傷很小，適于活體觀察，光漂白作用也小；2）在組織中由于700～1000nm近紅外光比可見光的透過率高，可達(dá)幾個厘米，因此可觀察樣品中更深層的熒光像，能夠進(jìn)行體外或在體內(nèi)的非破壞、非介入性分析；3）許多原本只能在可見區(qū)甚至是紫外區(qū)使用的熒光探測試劑也可以應(yīng)用在近紅外區(qū)域。金納米棒的縱向共振峰通過調(diào)整長徑比率可以精確調(diào)控到近紅外區(qū)域，而這一近紅外波長范圍正是生物組織所具有的光的窗口，光穿透血管和其下面的組織，克服了可見光不能很好穿透組織的壁壘。金納米棒是一種理想的“雙光子熒光”成像類型，能比常規(guī)的熒光影像提供更高的對比度和亮度。這種高對比度的“非線性光學(xué)技術(shù)”具有靈敏檢測早期癌細(xì)胞的能力。另外，與球形金顆粒相比，棒狀金顆粒具有更為特殊的表面等離子體共振(SPR)特性，通過控制不同長短軸比可以實現(xiàn)縱向SPR峰位置的人為調(diào)控(從可見光區(qū)到近紅外光區(qū))。由于金納米棒表面SPR的強吸收導(dǎo)致的發(fā)光特性，使其在生物組織成像，癌癥的診斷和治療中存在著巨大的應(yīng)用前景。結(jié)合配體的金納米棒能夠特異性地標(biāo)記癌癥細(xì)胞上的受體，并提供特定分子的特有信息，進(jìn)行生物成像和癌癥檢測。2005年美國Purdue大學(xué)的研究人員Wang等將金納米棒顆粒注入實驗鼠體內(nèi)，在其流經(jīng)血管時,利用雙光子成像技術(shù)(TPL)透過皮膚得到了血管結(jié)構(gòu)的原位圖像。記錄的圖像比傳統(tǒng)熒光染料法明亮得多，單個金納米棒顆粒比單個羅丹明6G分子發(fā)出的雙光子熒光要亮58倍。圖2單個金納米棒在實驗鼠耳血管的原位成像：(a)兩個血管的發(fā)射圖像；(b)通過血管的金納米棒顆粒的雙光子圖像；(c)發(fā)射圖和單幅的雙光子圖像的疊加圖；(d)與c圖對應(yīng)的雙光子強度譜圖3.2免疫檢測生物活性物質(zhì)如抗體蛋白等，由于自身可檢測的信號比較弱，難以定量分析或檢測。為此需引入外源標(biāo)記物，通過其強的可檢測信號來定量或示蹤極微量的生物活性物質(zhì)。已有的標(biāo)記免疫分析包括酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、電化學(xué)免疫分析和熒光免疫分析等。其中熒光分析以其無污染性及高靈敏度等特點而被廣泛應(yīng)用，是最為成熟和普及的標(biāo)記技術(shù)。近年來，基于量子點熒光的生物標(biāo)記技術(shù)也日益受到重視。但熒光譜峰較寬，信號的選擇性相對較差；若用熒光分子標(biāo)記，還存在光解和光致褪色現(xiàn)象，因而熒光標(biāo)記技術(shù)亦有其局限性。近年來隨著納米科技的快速發(fā)展,SERS標(biāo)記技術(shù)已引起了國內(nèi)外科學(xué)家的廣泛關(guān)注。首先，拉曼光譜具有高度的分子特征性，且譜峰窄，能減小不同分子間的譜峰重疊。其次，在多元檢測中一種波長的激發(fā)光就能激發(fā)出不同的拉曼活性分子的譜峰。第三，SERS信號很少受光漂白的影響，可在一定程度上為獲得較好的SERS信號而延長積分時間。第四，SERS信號不象熒光分子那樣易發(fā)生自淬滅現(xiàn)象，可通過增加拉曼活性分子數(shù)目來提高信號強度，從而提高免疫檢測的靈敏度。金納米棒有著獨特的光學(xué)性質(zhì)，它有兩個等離子體共振(SPR)吸收帶：橫向SPR吸收峰和縱向SPR吸收峰，其中縱向等離子體吸收峰的位置可以隨其長徑比的增大而逐漸紅移。金納米棒SPR的這種可調(diào)性使其能作為很好的SERS基底。因為按照SERS的電磁場增強機制，當(dāng)激發(fā)光和SPR共振時，可以最大程度提高單個納米顆粒的增強能力?；诮鸺{米棒表面增強拉曼散射(SERS)的免疫檢測。將拉曼活性分子對巰基苯甲酸吸附于金納米棒表面，制備出SERS標(biāo)記的金納米棒探針。該探針和蛋白抗體結(jié)合形成SERS標(biāo)記抗體。通過SERS標(biāo)記抗體、待測抗原和俘獲抗體(固體基底上修飾的抗體，即俘獲抗體)之間的免疫應(yīng)答反應(yīng),將金納米棒探針組裝到固體基底上，形成SERS標(biāo)記抗體-抗原-俘獲抗體“三明治”夾心復(fù)合體。待測抗原濃度越大，固體基底上俘獲的金納米棒探針的數(shù)目越多，從而可通過SERS信號的強弱來檢測待測抗原的濃度。由于金納米棒的表面等離子體共振(SPR)峰位置可以在較寬的范圍內(nèi)調(diào)控，可通過激發(fā)光和SPR的耦合來提高SERS信號，從而提高免疫檢測的靈敏度。單組分抗原可檢出的濃度范圍高于1×10－8mg/mL。圖3SEM圖（a）DSP-羊抗鼠IgG修飾的金基底（插圖是沒被修飾的金基底）（b）DSP-羊抗鼠IgG-鼠IgG修飾的金基底（c）鼠IgG濃度為1×10-4mgmL-1組裝的三明治結(jié)構(gòu)（插圖是沒有鼠IgG的情況）（d）鼠IgG濃度為1×10mgmL-1組裝的三明治結(jié)構(gòu)3.3癌癥診斷和治療金納米棒總的消光包括散射和吸收兩部分，對于直徑小于10nm的金納米棒，光的吸收遠(yuǎn)大于散射，而吸收的這部分能量最終將通過晶格的弛豫轉(zhuǎn)化為熱能。另一方面，對于生物體來說，近紅外波段的輻射具有窗口效應(yīng)，該頻段的輻射能夠以微弱的損失穿透生物體組織。因此可以利用金納米棒在近紅外波段較高的光吸收截面和優(yōu)良的光熱轉(zhuǎn)換效率來制造光熱療法的試劑。通過在金納米棒表面包覆一層與體液相容性良好的聚合物分子，金納米棒可以在生物活體內(nèi)進(jìn)行長達(dá)15小時的流通與傳輸。科學(xué)家已經(jīng)證明，金納米棒以及相關(guān)的納米結(jié)構(gòu)可以通過光熱療法，在較小的光照劑量下殺死癌細(xì)胞。許多癌細(xì)胞的表面都覆蓋著表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EFGR)，EFGR為癌癥提供治療新靶點,而健康細(xì)胞則不會明顯地顯示出這種蛋白質(zhì)。El-Sayed等將金納米顆粒與抗-EFGR結(jié)合，用于選擇性標(biāo)記癌細(xì)胞，在暗場光學(xué)顯微鏡下可以實現(xiàn)癌細(xì)胞的成像。對于常用的球形金納米顆粒對可見光的強吸收特性使得光能可以轉(zhuǎn)換為熱能，因此采用球形金納米微粒輔助激光熱作用方法，可以達(dá)到對癌細(xì)胞的選擇性破壞。和正常細(xì)胞相比，殺死癌細(xì)胞只需一半的激光能量，而且不損害良性細(xì)胞。對于皮膚癌治療或者診斷，球形金納米顆粒是很好的選擇。然而由于可見光不容易穿透生物組織，因此對于皮下組織的癌癥的治療或者診斷，球形金納米顆粒就無能為力了。具有合適比率的金納米棒顆粒則是很好的選擇，因為它在近紅外區(qū)(800—1200nm)對光的吸收和散射能力都很強。選擇與金納米棒顆粒LSPR波長相匹配的近紅外激光作為光源，能夠誘導(dǎo)皮下深層組織的金納米棒顆粒產(chǎn)生熱量，使之升溫，因此金納米棒顆粒對皮下深層組織的癌細(xì)胞能同時起到診斷(成像)和光熱治療的雙重作用。El-Sayed等報道利用寡肽標(biāo)記的金納米棒進(jìn)行細(xì)胞核標(biāo)記，在暗場光學(xué)顯微鏡下，可以清楚地把癌細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)分開(見圖4)，并且使用800nm的激光照射可以選擇性地殺死癌細(xì)胞(見圖5)。圖4納米棒，分別與HaCaT細(xì)胞、HSC細(xì)胞和HOC細(xì)胞在室溫下孵育30min后的光散射照片圖5anti-EGFR/Au納米棒與癌細(xì)胞孵育后，選擇性光熱治療癌細(xì)胞第四章總結(jié)與展望Au納米棒獨特的光學(xué)性質(zhì)使其在生物醫(yī)學(xué)、生化標(biāo)記、成像分析、信息存儲等領(lǐng)域有了廣闊的應(yīng)用前景。納米材料在生物體內(nèi)相容性的問題研究才剛剛起步，如何將神奇的納米材料和現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合，使得Au納米棒在生物標(biāo)記、免疫檢測、熒光探針、生物成像、生物傳感、疾病診斷和光熱治療以及信息存儲等領(lǐng)域應(yīng)用健康發(fā)展，還需要在這個學(xué)科方向中開展更深入廣泛的研究。目前更多的是關(guān)注金納米棒的制備調(diào)控及應(yīng)用，而對金納米棒在不同環(huán)境下的形成機理卻無系統(tǒng)理論解釋，進(jìn)一步探索并發(fā)現(xiàn)金納米棒的生長機制及規(guī)律將成為一個重要的研究方向。處于外界介電環(huán)境中的金屬納米顆粒的LSPR光譜特性由以下幾個方面決定，納米顆粒的半徑α、納米顆粒形狀以及納米顆粒所處環(huán)境的介電常數(shù)。而金納米棒尚無完善的LSPR光學(xué)響應(yīng)理論模型，進(jìn)一步發(fā)展及完善貴金屬納米粒子的光學(xué)響應(yīng)模型是下一步理論研究的重點。目前只有對納米粒子的形貌、大小以及分布進(jìn)行靈活的調(diào)控，才能制備出所需要的納米傳感器件，使其更好的應(yīng)用于納米傳感、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。參考文獻(xiàn)【1】柯善林,闞彩俠,莫博等.金納米棒的光學(xué)性質(zhì)研究進(jìn)展[J].物理化學(xué)學(xué)報,2012，28(6):1275-1290.【2】繆煜清,劉仲明,官建國.納米技術(shù)在生物傳感器中的應(yīng)用[J].傳感器技術(shù),2002,21(11).【3】曹艷麗,丁孝龍,李紅臣等.形貌可控貴金屬納米顆粒的合成、光學(xué)性質(zhì)及生長機制[J].物理化學(xué)學(xué)報,2011，27(6),1273-1286.【4】郭紅燕,盧玲慧,吳超等.SERS標(biāo)記的金納米棒探針用于免疫檢測[J].化學(xué)學(xué)報,2009,67(14).【5】范艷平.金納米棒制備綜述[J].化學(xué)工程與裝備,2011.【6】楊淑華,王怡,周勇等.金納米棒制備、修飾及與寡核苷酸適配子的偶聯(lián)[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2010,34(6).【7】馬占芳,田樂,邸靜等.基于金納米棒的生物檢測、細(xì)胞成像和癌癥的光熱治療[J].化學(xué)進(jìn)展,2009，21(1).【8】王明星,何婧琳,曹忠.金納米棒的合成及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].廣東化工,2011,38(8).【9】楊玉東,徐菁華,楊林梅等.金納米棒的光熱性質(zhì)及其在生物醫(yī)學(xué)成像和光熱療法中的應(yīng)用[J].激光與光電子學(xué)進(jìn)展,2010.【10】沈順.介孔二氧化硅包覆金納米棒的腫瘤熱療-化療聯(lián)合治療研究[D].上海,復(fù)旦大學(xué),2012.【11】王春剛.金納米棒的表面修飾及其生物識別的研究[D].吉林長春,東北師范大學(xué),2007.【12】余金妹.金納米棒的二氧化硅表面修飾及生物相容性研究[D].安徽合肥,安徽醫(yī)科大學(xué),2012.【13】張?zhí)炷?金納米棒-生物靶向分子耦合體制備及應(yīng)用研究[D].吉林長春,長春理工大學(xué),2012.【14】鄒楠.金納米棒復(fù)合材料的合成及其表面增強拉曼散射研究[D].吉林長春,長春理工大學(xué),2010.【15】黃劭文.基于金納米棒局域表面等離子體共振構(gòu)建生物傳感器的研究[D].湖南湘潭,湖南科技大學(xué),2011.【16】A.Brioude,X.C.Jiang,M.P.Pileni.Opticalpropertiesofgoldnanorods:DDAsimulationssupportedbyexperiments[J].J.Phys.Chem.B,2005,109(27):13138～13142.【17】K.G.Thomas,S.Barazzouk,B.I.Ipeetal..UniaxialPlasmoncouplingthroughlongitudinalself-assemblyof