基因工程-第三章-基因工程的載體

第三章基因工程的載體載體：攜帶外源基因進入受體細胞的工具用于基因工程的載體細菌質(zhì)粒載體噬菌體λ衍生載體Cosmid載體Phagemid載體酵母質(zhì)粒載體真核病毒載體Bacmid載體1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新發(fā)展概況

1.

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)

2.

第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。

3.第三階段：進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第三章基因工程的載體作為基因工程載體的基本功能1.運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞2.為外源基因提供復制能力或整合能力3.為外源基因的擴增或表達提供條件1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第三章基因工程的載體作為基因工程載體必須具備的基本條件1.具有對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）2.具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點3.長度盡可能小，以提高其載裝能力4.具有多種單一的酶切位點5.具有合適的選擇性標記1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新遺傳標記基因

1.標記基因的作用

1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞

這種指示可以是選擇性的（Apr

，Tcr

，Kanr），也可以是非選擇性的（如lacZ）

2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。

*這種指示也可以是選擇性的（如TcS），也可以是非選擇性的（如TcS，

lacZα,GUS），絕大多數(shù)為后者。

**有的遺傳標記基因可以完成上述兩項作用。當充任第一作用時，最好是選擇性標記基因；當完成第二作用時，目前多采用非選擇性的—檢測性標記基因。有的基因是不能用作選擇性標記基因（lacZ，GUS等）。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新2.

標記基因的種類

1）抗性標記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr

，Tcr

，Cmr，Kanr，G418r，Hygr

，Neorb.重金屬抗性基因:Cur

，Znr

，Cd

rc.代謝抗性基因:TK，抗除草劑基因

2）營養(yǎng)標記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。

3）生化標記基因

其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應，如lacZ,GUS,CAT

4）噬菌斑

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

3.

使用標記基因注意要點

1）標記基因與宿主細胞

2）標記基因產(chǎn)物的作用機制:Apr3）標記基因的結(jié)構(gòu)與適用范圍:基因啟動子,翻譯起始序列,密碼子偏愛性

4）標記基因的結(jié)構(gòu)變化對功能的影響:LacZ,GUS

4.

常用的遺傳標記基因

1)四環(huán)素抗性基因（Tcr）

Tetracycline可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399AAs蛋白質(zhì)，與細菌細胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進入細菌細胞。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新2)氨芐青霉素抗性基因（Apr）

Ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質(zhì)的酶，催化β—內(nèi)酰胺環(huán)的水解，使氨芐青霉素失活。3)氯霉素抗性基因（Cmr）

Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；瑢е乱阴；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因

Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。來自轉(zhuǎn)座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進入細胞內(nèi)。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ

和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負責四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZα）均可作為標記基因。

β—半乳糖苷酶基因的優(yōu)點:

a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀

b.lacZα編碼5'-端可容許很大的變化而不影響酶活性

c.lacZα和β鏈基因的分別表達可使載體小而容量大1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

PLacZα

LacZβ

轉(zhuǎn)錄

翻譯

αβLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18BamHI片段重組DNA分子轉(zhuǎn)化E.coli外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS）

該基因編碼一種可分解各種β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。

7）熒光素酶基因

熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細菌（Photobacterium

fischeri）產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。

8）發(fā)光蛋白質(zhì)基因

發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍色。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新分子克隆載體的復制起點與種類

1.復制起點的種類

1)核內(nèi)復制起點

a.染色體復制起點—原核生物(環(huán)狀)和真核生物(線狀)染色體

b.染色體外復制起點

i.質(zhì)粒—DNA,RNA,線狀,環(huán)狀,單鏈,雙鏈

ii.病毒—同上,細胞內(nèi)和病毒顆粒內(nèi)

2)核外復制起點

a.線粒體—所有真核細胞

b.葉綠體—所有綠色植物細胞

原核與真核生物兩種質(zhì)體中亦可能含有質(zhì)粒1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

3.按復制起點劃分克隆載體

1)質(zhì)粒復制型—復制起點來自質(zhì)粒或線粒體和葉綠體

2)ARS復制型—ARS（autonomus

replicativesequence)，或稱染色體復制型

3)病毒復制型—復制起點來自病毒，若為RNA病毒，必須反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

4)混合復制型

a.

同種生物復制起點混合—質(zhì)粒形式存在；質(zhì)?；虿《拘问酱嬖?/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

例：大腸桿菌（E.coli）的噬粒（phagemid）載體既含有來自質(zhì)粒的復制起點，又含有來自噬菌體（如M13）的復制起點。在不同條件下，它可以質(zhì)粒或噬菌體的復制起點進行復制，從而獲得質(zhì)粒ds-DNA或噬菌體ss–DNA又如：釀酒酵母（Saccharomyces

cerevisiae）的某些載體既含有質(zhì)粒（2μ）復制起點，又含有ARS片段

b.

不同生物復制起點混合—穿梭載體（shuttlevector）兩種生物中均以質(zhì)粒形式存在；在一種生物中以質(zhì)粒形式存在，在另一種生物中以質(zhì)?；虿《拘问酱嬖?穿梭載體范圍：細菌—細菌（放線菌），細菌—酵母菌，細菌—真菌，細菌—動物1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新pBS載體的結(jié)構(gòu)1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新分子克隆載體的復制起點種類、標記基因與拷貝數(shù)的關系

1.復制起點種類與拷貝數(shù)間的關系

1)質(zhì)粒復制起點類型：低拷貝（嚴緊型，1-2copies，受宿主染色體基因控制）；高拷貝（松弛型，>20copies，受宿主染色體控制較弱）

2)ARS型載體：拷貝數(shù)較高（約20copies）

3)病毒型復制起點：高拷貝

2.

標記基因與拷貝數(shù)的關系

若標記基因表達效率高，宿主細胞可能不大量產(chǎn)生標記基因以滿足選擇壓力要求，因而載體拷貝數(shù)會降低。對于不同標記基因，可采取相應方法提高其拷貝數(shù)。

如：對于藥物抗性標記基因，可提高藥物濃度。對于營養(yǎng)標記基因，可降低該基因的表達效率或更換其他低效率的標記基因1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新分子克隆載體的轉(zhuǎn)化頻率和穩(wěn)定性

1.影響轉(zhuǎn)化頻率的因素

1)復制起點類型：盡可能選擇高拷貝復制起點

2)標記基因：盡可能選擇高效表達的標記基因

2.

影響穩(wěn)定性的因素

1)

復制起點類型—低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性差

2)

選擇壓力

3)

載體在宿主細胞中的狀態(tài)—自主復制型和整合型宿主細胞的遺傳特性和生理特性1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)1、定義質(zhì)粒是存在于細菌細胞質(zhì)中獨立于染色體而自主復制的共價、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA）1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征自主復制性質(zhì)粒DNA攜帶有自己的復制起始區(qū)（ori）以及一個控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因，因此它能獨立于宿主細胞的染色體DNA而自主復制1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征不相容性利用同一復制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒（RNAIRNAIIRop因子）如果被導入同一細胞中，它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中，就會彼此競爭，幾種質(zhì)粒中只能有一種長期穩(wěn)定地留在細胞中，這就是所謂的質(zhì)粒不相容性。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征可擴增性pMB1或ColEI類質(zhì)粒在蛋白質(zhì)合成中斷時，質(zhì)粒復制能持續(xù)合成，這樣當用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復制時，帶有pMB1或ColEI復制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復制，最后每個細胞可以積聚2000-3000個拷貝，這叫做氯霉素擴增。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征攜帶遺傳標記

在實驗室中將質(zhì)粒通過物理方法導入受體細胞，但是即使在最佳條件下，受體細胞中也只有少數(shù)細胞能穩(wěn)定地接受質(zhì)粒，要想找到這些進入了質(zhì)粒的受體細胞，就要利用載體質(zhì)粒上的遺傳標記，天然質(zhì)粒上碰巧攜帶許多功能基因，它們便可被用作選擇標記。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)3、分類

接合型和非接合型嚴緊性和松弛型在基因工程中使用的質(zhì)粒都是松弛型質(zhì)粒1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建1、理想質(zhì)粒載體所具備的條件質(zhì)粒較小質(zhì)粒帶有可供選擇的標記帶有盡可能多的單一限制酶切位點應有較高的基因表達能力1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建2、質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的

天然質(zhì)粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對之進行改造構(gòu)建：（1）加入合適的選擇標記基因，如兩個以上，易于用作選擇

（2）增加或減少合適的酶切位點，便于重組

（3）縮短長度，切去不必要的片段，提高導入效率，增加裝載量

（4）改變復制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝

（5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件方法就是重組，拼拼接接，挖肉補瘡。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新多拷貝質(zhì)粒經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)負調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)粒拷貝數(shù)達到每個細胞數(shù)千，用于擴增外源基因。

測序質(zhì)?？截悢?shù)高，加裝測定順序所必需的序列，如多切口接頭，便于各種片段方便克隆

整合質(zhì)粒裝有整合促進基因及整合特異序列，便于外源基因準確重組整合入受體細胞的染色體上

穿梭質(zhì)粒

含有兩個不同的復制子，能在兩種不同的受體細胞中復制

表達質(zhì)粒裝有強的啟動基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細胞內(nèi)的高效表達

探針質(zhì)粒篩選克隆或?qū)ふ一蛟?，他通常裝有一個可以定量測定其表達的標記基因，如抗性基因。篩選啟動基因、終止子等。

人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為：1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建3、人工組建克隆載體-pBR322大?。?.3kb選擇標記：Apr

Tcr單一酶切位點：EcoRⅠHindⅢBamHⅠPstⅠISalⅠ等1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建3、人工組建克隆載體-pBR322用于組建pBR322的三個親本質(zhì)粒的特征：pSE2124：Apr基因pMB8:ColEI松弛型復制子pSC101:Tcr基因1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建4、人工組建克隆載體-pUC系列質(zhì)粒多拷貝大腸桿菌型質(zhì)粒，包括pUC8/9pUC18/19pUC的親本質(zhì)粒是pBR322,包括如下四個部分：來自pBR322的復制起點（ori）來自pBR322的Apr基因（核甘酸序列已發(fā)生改變）E.coli的lacZ基因及其啟動子組成lacZ‘基因lacZ‘內(nèi)部人工組裝了一個多克隆位點（MCS）它含有如下單一酶切口：EcoRI、SstI、KpnI、SmaI、BamHI、XbalI、PstI、SphI、HindIII，。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建4、人工組建克隆載體-pUC系列質(zhì)粒pUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點更小的相對分子量和更高的拷貝數(shù)可用組織化學法檢測重組體具有多克隆位點（MCS）區(qū)段是基因工程中目前最常用的E.coli克隆載體1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體三、質(zhì)粒（plasmid）的制備堿裂解法

（1）將菌體懸浮在含有EDTA的緩沖液體中

（2）加溶菌酶裂解細菌細胞壁

（3）加NaOH與SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

（4）加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)

（5）離心取上清液，用苯酚－氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質(zhì)及核酸酶

（6）乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒

（7）無DNase的RNase處理殘余RNA1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體三、質(zhì)粒（plasmid）的制備沸水浴法

（1）將菌體懸浮在含有EDTA和TritonX-100的緩沖液中

（2）加溶菌酶破細胞壁

（3）放入沸水浴中煮40秒

（4）離心，用無菌牙簽挑去沉淀物

（5）乙醇異丙醇沉淀1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新一、Ti質(zhì)粒載體

1.

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium

tumefaciens)與Ti質(zhì)粒

G-菌，可侵入90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤(crowngalltumor)。冠癭瘤細胞具有以下特征：

i.不需要補充植物激素便可進行離體培養(yǎng)

ii.合成腫瘤特有的化合物—冠癭堿(opine)，能專一的為根癌農(nóng)桿菌所利用.這兩個特征由Ti質(zhì)粒決定，但該質(zhì)粒中僅有一部分進入植物細胞。

三、其他質(zhì)粒載體1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1)

Ti質(zhì)粒類型（由Ti質(zhì)粒所產(chǎn)生的冠癭堿種類而定）

i.鱆魚堿類(octopine)ii.胭脂堿類(nopaline)iii.農(nóng)堿類(agropine)2)Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

i.環(huán)狀ds-DNA,160-250kb，具六個功能區(qū)

i)致瘤區(qū)：合成植物生長素和細胞分裂素

ii)冠癭堿合成區(qū)：參與冠癭堿合成

iii)冠癭堿分解區(qū)：參與冠癭堿分解

iv)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)：參與不同農(nóng)桿菌中的接合轉(zhuǎn)移

v)毒（性）區(qū)：參與T-DNA的轉(zhuǎn)移和插入植物染色體

vi)DNA復制區(qū)：參與Ti質(zhì)粒DNA復制1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

ii.T-DNAT-DNA包括植物激素冠癭堿合成區(qū)基因及兩側(cè)相同的25bp重復序列，T-DNA整合不具特異性，右側(cè)25bp重復序列對T-DNA的轉(zhuǎn)移至關重要。不同Ti質(zhì)粒中的T-DNA結(jié)構(gòu)是不相同的，其中

i)胭脂堿Ti質(zhì)粒的T-DNA長23bp,結(jié)構(gòu)連續(xù)，具13個基因

ii)鱆魚堿Ti質(zhì)粒中的T-DNA不連續(xù)，分左右兩段，分別稱之為TL和TR,TLDNA長13.2kb,含8個基因，包括鱆魚堿合成酶和植物激素合成基因,TR

–DNA長7.9kb，含5個基因，參與甘露堿(mannopine)和農(nóng)堿合成

iii)兩者同源性：主要集中在植物激素合成區(qū)。

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新Ti質(zhì)粒的T-DNA的同源性

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新2.

Ti質(zhì)粒載體

1)Ti質(zhì)粒作為載體的問題

i)太大，無適合克隆位點

ii)T-DNA的存在不能使轉(zhuǎn)化細胞再生為完整植株

2)載體類型

i)中間載體(intermediatevector)

由以下幾部分組成：

適合于E.coli和A.tumefaciens自主復制和選擇用標記基因適合于植物細胞選擇用標記基因一段來自天然Ti質(zhì)粒的部分T-DNA序列（提供同源重組）

1-2個來自T-DNA的25bp重復序列用于表達外源基因的DNA序列（如啟動子、終止子序列）1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

重組DNA的轉(zhuǎn)移過程：中間載體或重組子E.coli(中宿主)A.tumefaciens

在根癌農(nóng)桿菌中與天然Ti質(zhì)?；蚍侵铝鲑|(zhì)粒發(fā)生共整合作用感染植物受傷組織或與植物細胞共培養(yǎng)

T-DNA進入植物細胞并整合到染色體DNA中外源基因表達轉(zhuǎn)化接合轉(zhuǎn)移

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新根癌農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新Ti質(zhì)粒衍生的植物克隆載體

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新二、釀酒酵母(Saccharomycea

cerevisiae)的分子克隆載體

1.克隆載體的種類

1)

按復制方式劃分

i.

自主復制型；

ii.整合型（非自主復制型）YeastIntegrationplasmid(YIp)

2)按復制子來源劃分

i.附加體型-yeastepisomal

plasmid(YEp)，其復制起點來自于釀酒酵母的天然質(zhì)粒-2μ質(zhì)粒

ii.染色體復制型-YeastReplicatingplasmid(YRp)，其復制起點來自染色體上的自主復制序列(ARS-autonomousreplicatingsequence)三、其他質(zhì)粒載體1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新釀酒酵母載體的種類和構(gòu)建

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

*若在YRp中插入釀酒酵母的著絲粒序列，該種載體YCp-YeastCentrometricplasmid**若在YCp

或YRp

中插入一段酵母的端粒結(jié)構(gòu)，該質(zhì)粒稱之為YLp-YeastLinearplasmid***若將YLp質(zhì)粒構(gòu)建成環(huán)狀分子,該質(zhì)粒稱之為pYAC載體(YeastArtificialChromosome)3)標記基因

大多數(shù)是以酵母菌氨基酸或堿基合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因作為選擇標記，如ARG4，LEU2，TRP1，HIS3和URA3。使用這些遺傳標記時，受體菌應是相應標記基因的突變型，且是穩(wěn)定的突變體（缺失突變或多點突變），利用遺傳互補進行轉(zhuǎn)化體選擇的，重組子則是靠在E.coli的轉(zhuǎn)化體中來鑒別的。

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

2.酵母克隆載體的結(jié)構(gòu)與特點

1)

穿梭載體，YIp除外

2)

有適合兩種生物的標記基因

3)

環(huán)狀或線狀DNA

詳見下表

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新載體類型存在方式所需DNA序列標記基因轉(zhuǎn)化頻率穩(wěn)定性

（菌落/μgDNA）無絲分裂有絲分裂

整合型整合與染色體DNAApr

Tcr<10+a+a

(YIp5)1-幾個拷貝同源

URA3

附加體型自主復制2μ質(zhì)粒Apr

Tcr

103-104

-b-c(YEp13)多拷貝LEU2

復制型自主復制ARSApr

Tcr

103-104-b-c(YRp7)多拷貝TRP1

著絲粒型染色體狀ARS,CENApr

103-104+d+d(YCp19)通常單拷貝TRP1,URA3

線型染色體狀ARS，CENTRP1，HIS3

103-104+e+(YLp21)通常單拷貝TEL

a.每次細胞分裂仍有約1%的載體DNA從染色體上脫落下來b.在選擇培養(yǎng)基中15-20代后，10-30%的轉(zhuǎn)化子丟失載體DNAc.非孟德爾式分離，主要是4+：0-d.無絲分裂時有3-14%轉(zhuǎn)化體丟失質(zhì)粒，有絲分裂時有3%轉(zhuǎn)化體質(zhì)粒不發(fā)生分離在選擇培養(yǎng)基上丟失質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體低于1%釀酒酵母各種載體的特征1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新3.YEp載體

1)酵母2μ質(zhì)粒

i.結(jié)構(gòu)

ii.

結(jié)構(gòu)特點

2μ質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

2μ質(zhì)粒倒置區(qū)的同向和反向重復片段1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新2）2μ質(zhì)粒載體

YIp中可插入整個或部分2μ質(zhì)粒DNA構(gòu)成YEp。大多數(shù)釀酒酵母菌株中都含有2μ質(zhì)粒，YEp復制所需的酶可由2μ質(zhì)粒提供。

YEp具有YRp載體相同的特點，它還可以與2μ質(zhì)粒發(fā)生重組。重組質(zhì)粒不穩(wěn)定，在無選擇壓力條件下可很快消失。利用此特點可除去酵母菌株中的天然質(zhì)粒，即[Cir+][Ciro]

當YEp進入宿主細胞后，其轉(zhuǎn)化體內(nèi)所含DNA可得如下雜交圖譜（設YEp為8kb，BamHI有一單切點）1-YEp13探針;2-2μ質(zhì)粒探針;3-LEU2探針;4-pBR322探針1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新4.pYAC載體

酵母菌人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)廣泛用于構(gòu)建高等動植物基因組文庫的構(gòu)建,由YLp經(jīng)適當改造后構(gòu)建成pYAC載體。pYAC載體具有以下特點：

1）

雙TEL位點；

2）

三個酵母菌遺傳標記基因；

3）

一個SUP4基因用于檢測重組子，其原理是：SUP4是tRNAtyr的赭色抑制突變基因，但把該基因轉(zhuǎn)入酵母菌的ade2赭色突變體時，宿主菌為白色菌落，要是在SUP4基因中插入外源DNA片段后在轉(zhuǎn)化ade2宿主菌，轉(zhuǎn)化子成紅色菌落。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新YAC:酵母人工染色體（yeastartificialchromosome）目前能容納最大外源DNA片斷的載體.YAC載體有兩個臂，每個臂的末端有一個端粒（TEL），臂上有著絲粒（CEN）、自主復制序列（ARS）、選擇標記（TRP1和URA3）裝載容量：50Kb---2000KbYAC載體是以質(zhì)粒的形式出現(xiàn)，如：pYAC21/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新pYAC載體的結(jié)構(gòu)1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體一、l噬菌體的分子生物學l噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和lDNA組成1.l-DNA的物理圖譜

l-DNA為線狀雙鏈DNA分子，兩端各有一個12核苷酸的互補單鏈（粘性末端），稱為cos區(qū)，全長48.5kb。

左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負責裂解宿主細胞，DNA自主復制以及調(diào)控基因，中間是負責與宿主染色體DNA遺傳重組整合的基因1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cI

cro

cIIOPQSR

att

int

xis

gamredcIIINCOS

COS

頭部基因尾部基因功能不明區(qū)

溶源化重組早期控制阻遏

DNA合成溶菌生長非必須區(qū)段cI基因：溶源過程控制基因。λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephage

cosendsCircularformLinearform1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體一、l噬菌體的分子生物學1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

溶源階段

(整合到寄主染色體上)48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)λphage1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建天然的l－DNA由于包裝上下限的存在以及同種酶切口太多不適合作為重組實驗的載體1.縮短長度

野生型l－DNA包裝的上限為50.9kb，本身長度為48.5kb，那么外源DNA片段允許插入的大小至多為2.4kb，這樣才能被包裝成有感染能力的噬菌體顆粒，如果將縮短便提高裝載量。其實l－DNA上約有40-50%的DNA片段（J-N區(qū)間）是復制，裂解所不必需的，將之切除便可提高載量。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建縮短長度

插入型載體

該類載體經(jīng)改造后的長度為37kb，有單一酶切位點，便于外源DNA的插入。其允許插入片段最大為13.9kb。根據(jù)插入失活效應的特異性分為兩種亞型：免疫功能失活插入型載體β－半乳糖苷酶失活插入型載體1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新插入式載體：

cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點。外源基因插入后將導致cI基因的失活。cI基因失活后將導致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

cIEcoRI

LA32.7RA10.6

λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRI

Charon

16A1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建縮短長度

替換型載體（取代型載體）

該類載體經(jīng)改造后的長度約為40kb，但在非必需區(qū)域內(nèi)含有兩個相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），兩者間的距離為14kb長，使用時用酶切開，分離去除這個14kb長的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新Lac

5

EcoRI

EcoRIEcoR

IBamHISalISalIBamHIEcoRICharon4AEMBL3/4Charon

401/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建刪除重復的酶切口插入型載體在插入位點有一酶切口，但這必須是唯一的；取代型載體在取代位點有兩個酶切口，多了也不行天然的l-DNA上有許多重復的酶切口，如：EcoRI5個，HindIII7個，這些多余的酶切口必須被刪除。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建構(gòu)建琥珀型密碼子突變體

終止密碼子有三種：UAA（赭石）；UGA（乳白）；UAG（琥珀）

琥珀型突變：CAG-UAG（stop）

將野生型λ-DNA上A和B兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG，當這種l-DNA進入一般大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的A和B頭部蛋白，也就不能被包裝，不能裂解細菌。阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體三、l-DNA作為載體的優(yōu)點l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌l-DNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量重組l-DNA的篩選較為方便4.重組l-DNA分子的提取比質(zhì)粒容易1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第三節(jié)

Cosmid載體一、Cosmid的定義

Cosmid（cossite—carryingplasmid）：是一類由人工構(gòu)建的含有l(wèi)-DNA兩端cos序列和質(zhì)粒復制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒復制子包括：一個復制起點和兩個抗性基因Apr

、Tcr。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新Cosmid載體的特點具有λ噬菌體的特性；具有質(zhì)粒載體的特性；具有較高容量的克隆能力；具有與同源性序列的質(zhì)粒進行重組的能力1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第三節(jié)Cosmid載體二、Cosmid的構(gòu)建

Cosmid含有l(wèi)-DNA兩端cos區(qū)的質(zhì)粒。由于l-DNA包裝時，其包裝蛋白只識別粘性末端附近的一小段順序，均1.5kb長。如果將這一小段DNA與質(zhì)粒連在一起，則這個重組質(zhì)粒就可裝載更大的外源DNA片段，同時它仍可象l-DNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體顆粒，并高效感染大腸桿菌，與λ噬菌體DNA所不同的是，Cosmid不能在體內(nèi)被包裝，更不能裂解細胞，它的制備與質(zhì)粒相同。進入細胞后，通過質(zhì)粒上的復制子進行復制。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第三節(jié)Cosmid載體三、Cosmid的優(yōu)越性1.能象l-DNA一樣體外包裝，并高效導入受體細胞2.可以裝載比質(zhì)?；騦-DNA大得多的外源DNA片段，如cos區(qū)及附近順序長為1.7kb，質(zhì)粒長為3.3kb，則該Cosmid最大可裝載45.9kb的外源DNA3.由于攜帶質(zhì)粒的選擇標記，便于篩選4.由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點，便于克隆。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新采用Cosmid作載體的困難①載體自身只相當于可以插入片段的1/10左右，因此往往會出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個重組分子內(nèi)可有幾個柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯亂地連接成一個片段，會影響實驗結(jié)果的分析，后來專門選出30～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時，每個載體只可能插入一個外源片段，因為如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；③細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費時間。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第四節(jié)單鏈DNA噬菌體M13一、M13單鏈噬菌體的分子生物學M13是一種單鏈DNA噬菌體，總長6407bp，閉合環(huán)狀正鏈ssDNA。噬菌體首先吸附大腸桿菌的雄性鞭毛上，然后穿過鞭毛內(nèi)孔將DNA注入細菌體內(nèi)。

單鏈DNA利用宿主細胞的復制另一條鏈（負鏈），形成dsDNA（RFDNA），故M13能以dsDNA的形式從細胞中分離作為克隆載體宿主細胞不會發(fā)生裂解。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新M13單鏈DNA噬菌體的生命周期1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新RFDNA1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新PhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新M13載體

具有多克隆位點(MCS)，方便克隆。許多M13載體的多克隆位點與質(zhì)粒載體pUC序列的多克隆位點是相同的，在克隆位點選擇上更為方便。可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13RFDNA分子上的雙鏈DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的形式。所以如果要同時分離ＤＮＡ分子中的雙鏈，則需要兩種獨立的克隆。根據(jù)M13的生物學特性知道，M13子代噬菌體中總是只含有（＋）鏈，所以M13載體克隆的外源DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源ＤＮＡ克隆時的取向。這樣一來，為分別分離外源ＤＮＡ分子的兩條鏈帶來一定的麻煩，解決這一問題的一個行之有效的方法就是定向克隆技術(shù)。

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新Blue-whiteselection1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新Blue-whiteselection1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新M13mp18MCSM13mp19MCSEcoRI

BamHI

HindIII

PstI

BglI

BglI

PstI

HindIII

BamHI

EcoRI

BP

PBBP

BPBPBamHI&PstI1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新M13克隆載體分子結(jié)構(gòu)圖1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第四節(jié)單鏈DNA噬菌體M13二、M13-DNA作為載體的優(yōu)點及用途1、最為顯著的優(yōu)點是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈，單鏈DNA的用途：

用于雙脫氧末端終止測定DNA順序用于單鏈DNA的定點誘變

用于合成探針1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第四節(jié)單鏈DNA噬菌體M13二、M13-DNA作為載體的優(yōu)點及用途2.篩選方便

感染的受體細胞生長緩慢，形成渾濁圈，易于挑選辨認而且重組分子越大，渾濁圈的渾濁度亦越大，這樣可以直接辨認哪些菌落含有外源DNA片段。1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新第五節(jié)其他載體一、BAC：細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome）

基于F因子建立起來的單拷貝E.coli載體，裝載容量300Kb，穩(wěn)定性較好，用于克隆大片端DNA，從而構(gòu)建整個人類基因組文庫1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新BAC載體1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragment.TheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragment.1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新PAC載體1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細胞的載體。由于動物細胞的培養(yǎng)和操作較復雜、花費也較多，因而病毒載體構(gòu)建時一般都把細菌質(zhì)粒復制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細胞。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40（SimianVirus40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等。動物分子克隆載體

1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新（一）

構(gòu)建動物克隆載體的病毒種類和特征

病毒類型例子病毒大小(nm)基因組結(jié)構(gòu)基因組大小(kb)細小病毒野生型H-1,RV,MVM20ss-DNA1.8-2.7

缺陷型AAV乳多空病毒乳實瘤兔,人(BPV)30-50環(huán)狀ds-DNA4.5-7.5

多型瘤小鼠腫瘤空泡SV40，BKV腺病毒人(AD)80-90ds-DNA30-40皰疹病毒

HSV,EBV100-150ds-DNA80-140痘病毒

300×200×100ds-DNA240-300逆病毒

MLV,MSV100-120ss-RNA8.51/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新（二）

病毒型載體

1.特點

1)

可在動物細胞中形成病毒顆粒（形態(tài)構(gòu)成組分來自天然病毒或原病毒細胞）

2)

DNA轉(zhuǎn)移效率高，但必須與天然(輔助)病毒共感染動物細胞

3)大多數(shù)被感染動物細胞將是致死的，但有少數(shù)病毒（如逆病毒）載體可穩(wěn)定整合到染色體DNA中。

4)插入病毒載體的外源基因只能在動物細胞中作瞬時表達

2.載體種類

根據(jù)構(gòu)建載體的病毒基因大小可分為兩類：1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新

1）復制型：由小分子病毒DNA構(gòu)建而成，具復制起點，其克隆位點可在病毒DNA之內(nèi)，亦可在病毒DNA之外，這類載體有的容量十分有限（如SV40），有的則很大（如HSV），其容量大小主要取決于病毒外殼蛋白的包裝能力。

2）非復制型：這類載體是在細菌克隆載體中插入一段病毒DNA（不含復制起點）。當外源DNA插入該載體后，與相應的天然病毒一起感染動物細胞，外源DNA可借助兩病毒DNA同源部分的重組插入天然病毒。這類載體特別適合于那些較大的病毒DNA分子。

實例：痘病毒長180kb,編碼150多種多肽，整個生存階段均在細胞質(zhì)內(nèi)，它能合成DNA復制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾的各種酶類，由此病毒構(gòu)建的非復制型載體就是在細菌載體中插入一段痘病毒DNA.1/7/2025蘇州科技學院生物系葉亞新（三）質(zhì)粒型載體

1.特點：不能形成病毒顆粒，以高拷貝質(zhì)粒形式存在于動物細胞內(nèi)，不導致動物細胞死亡。

2.組成：pMB1和病毒復制起點（如SV40，BPV，EBV等），適合于細菌和動物細胞的選擇標記基因。

3.

實例

1)

SV40質(zhì)粒載體

SV40具如下物理圖譜，5243bp,為兩種抗原（T-和t-抗原）和三種病毒衣殼蛋白編碼。其中T-抗原參與SV40的有效感染，并能特異地結(jié)合在病毒DNA復制起點上，這種結(jié)合對DNA復制是必須的。因復制起點與該基因的啟動子順序相近，故它本身的表達也受到T-抗原