DB14T-蘋果樹腐爛病抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范

Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14接種體制備 15鑒定條件和設(shè)計(jì) 26鑒定接種 27病情調(diào)查 28抗性結(jié)果 39鑒定結(jié)果 310檔案記錄 3附錄A（資料性）蘋果樹腐爛病病原菌 4附錄B（資料性）蘋果品種抗腐爛病鑒定結(jié)果記錄 6附錄C（資料性）蘋果品種抗腐爛病鑒定結(jié)果報(bào)告單 7附錄D（資料性）抗病性鑒定檔案記錄表 8前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件代替DB14/T1128—2015《蘋果樹腐爛病抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程》。與DB14/T1128—2015相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動(dòng)外，主要技術(shù)變化如下:——更改了接種體制備（見4，見2015版4）；——增加了鑒定條件和設(shè)計(jì)（見5）；——增加了鑒定接種（見6）；——更改了病情調(diào)查（見7，見2015版6.2）；——更改了抗性結(jié)果（見8，見2015版6.3）；——增加了鑒定結(jié)果（見9）；——增加了檔案管理（見10）。本文件由山西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出、組織實(shí)施和監(jiān)督檢查。本文件由山西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的組織實(shí)施情況進(jìn)行監(jiān)督檢查。本文件由山西省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SXS/TC19)歸口。本文件起草單位：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)。本文件主要起草人：殷輝、趙曉軍、呂紅、秦楠、任璐。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為；——2015年首次發(fā)布為DB14/T1128—2015；——本次為第一次修訂。蘋果樹腐爛病抗性鑒定技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了蘋果樹腐爛病抗病性鑒定的術(shù)語和定義、接種體制備、鑒定條件和設(shè)計(jì)、鑒定接種、病情調(diào)查、抗性結(jié)果、鑒定結(jié)果、檔案記錄。本文件適用于蘋果生產(chǎn)過程中腐爛病的抗病性鑒定。規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。接種體用于接種以引起病害的任何病原物或病原物的一部分。接種懸浮液用于接種的含有定量接種體的液體。接種室指在無菌的環(huán)境下進(jìn)行病原菌種擴(kuò)繁、轉(zhuǎn)接、接種的房間。接種體制備病原菌分離從病斑邊緣病健交界處剪取0.5cmx0.5cm大小的病組織，用75%乙醇消毒90s，然后用無菌水沖洗3次，用滅菌濾紙將水吸干，置于PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4℃下保存?zhèn)溆谩ＬO果腐爛病菌的學(xué)名、形態(tài)特征和分子生物學(xué)特征見附錄A。接種體繁殖將保存的病原菌在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)10d～15d，待菌落表面形成分生孢子器。其中，PDA培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。接種體懸浮液制備用滅菌移植針挑取菌落表面形成的分生孢子器并破碎收集分生孢子，將分生孢子并用無菌水稀釋配制成濃度約為1×106個(gè)孢子/mL的接種體懸浮液。鑒定條件和設(shè)計(jì)接種室接種室為可人工調(diào)節(jié)濕度、溫度和光照等條件，具體室溫為25℃、光周期12h光照/12h黑暗、相對(duì)濕度35%～40%。鑒定設(shè)計(jì)鑒定材料隨機(jī)排列，每份鑒定材料重復(fù)3次，每重不低于10個(gè)枝條，以紅富士健康樹枝條接種腐爛病菌為對(duì)照。鑒定材料田間采集用于抗性鑒定蘋果品種的健康、長(zhǎng)勢(shì)一致、無側(cè)枝2年生枝條，截取長(zhǎng)度為150cm并兩端蠟封。用自來水沖洗2次，75%酒精沖洗1次，無菌水沖洗1次，自然風(fēng)干備用。鑒定接種采用燙傷法接種，用直徑5mm的釘帽在在備用鑒定材料上燙傷5個(gè)傷口，傷口間距25cm。每個(gè)傷口接種10μL接種懸浮液，完成后用保鮮膜包扎燙傷部位，接種4個(gè)傷口，1個(gè)傷口為對(duì)照。將完成接種的枝條扦插在裝有細(xì)沙的花盆中，置于鑒定室培養(yǎng)。病情調(diào)查調(diào)查時(shí)間與方法接種后5d調(diào)查發(fā)病情況，用刀片刮除枝條接種點(diǎn)周圍樹皮，測(cè)量病斑長(zhǎng)度。接種蘋果腐爛病菌的發(fā)病癥狀描述見附錄A。病情級(jí)別蘋果離體枝條腐爛病病情級(jí)別見表1。蘋果離體枝條腐爛病病情級(jí)別病情級(jí)別嚴(yán)重度（mm）0不發(fā)病15＜病斑長(zhǎng)度≤10310＜病斑長(zhǎng)度≤15515＜病斑長(zhǎng)度≤20720＜病斑長(zhǎng)度≤259病斑長(zhǎng)度＞25病情指數(shù)計(jì)算病情指數(shù)（DI）按式（1）計(jì)算。 DI=各病情級(jí)別數(shù)值×各病情級(jí)別的抗性結(jié)果依據(jù)病情指數(shù)(DI)的平均值確定不同品種對(duì)腐爛病的抗性水平，抗性結(jié)果見表2。蘋果樹腐爛病抗性結(jié)果抗性結(jié)果病情指數(shù)（DI）免疫（I）DI=0高抗（HR）0＜DI≤10抗病（R）10＜DI≤30中抗（MR）30＜DI≤50感?。⊿）50＜DI≤70高感（HS）DI＞70注：對(duì)照感病品種的病情指數(shù)DI＞70作為有效性結(jié)果的依據(jù)。鑒定結(jié)果鑒定結(jié)果原始記錄表見附錄B，鑒定結(jié)果報(bào)告單按附錄C執(zhí)行。檔案記錄將鑒定品種、接種方法、接種日期、調(diào)查日期、操作員等內(nèi)容填表記錄，歸檔并保存2年?？共⌒澡b定檔案記錄表見附錄D。

（資料性）

蘋果樹腐爛病病原菌學(xué)名和形態(tài)描述學(xué)名蘋果樹腐爛病病原學(xué)名為蘋果殼囊孢（CytosporamaliGrove）、屬子囊菌門（Ascomycota）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、間座殼目（Diaporthales）、殼囊孢科（Cytosporaceae）、殼囊孢屬（CytosporaEhrenb.）。形態(tài)描述蘋果殼囊孢（CytosporamaliGrove）在PDA菌落白色至黃褐色、平展、邊緣呈放射狀，中央可產(chǎn)生乳白色分生孢子器。分生孢子器扁瓶形，直徑為480μm～1600μm。分生孢子單孢、香蕉形、兩端圓、微彎曲，大小（3.6μm～6μm）×（0.8μm～1.7μm）。（a）蘋果殼囊孢在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（b）蘋果殼囊孢分生孢子的形態(tài)蘋果殼囊孢的形態(tài)特征分子生物學(xué)特征將待提DNA的蘋果殼囊孢接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃下，光暗交替培養(yǎng)5d，后用滅菌牙簽刮取培養(yǎng)基表面菌絲，收集到滅菌的1.5mL離心管中，采用CTAB法提取菌株基因組DNA。以上述基因組DNA為模板，分別以引物對(duì)ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b和EF1-728F/EF1-986R（序列見表A1）擴(kuò)增ITS、β-tubulin和EF1-α基因。ITS引物對(duì)ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），β-tubulin引物對(duì)Bt2a（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’）和Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’）EF1-α引物對(duì)EF1-728F（5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’）和EF1-986R（5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’）。PCR反應(yīng)總體系為25μl，各組分如下：10×PCRreactionbuffer2.5μl，10mMdNTP0.5μL，正反引物（濃度為10mM）各0.5μl，1UExTaqDNA聚合酶（TaKaRa，Japan）0.25μL，模板DNA10-20ng，用ddH2O補(bǔ)至25μl。ITS和β-tubulin基因PCR的反應(yīng)條件一致，為94℃2min預(yù)變性；94℃變性60s，退火58℃60s，72℃90s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。EF1-α的擴(kuò)增條件為95℃3min預(yù)變性；95℃變性30s，退火55℃30s，72℃60s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠成像儀觀察，切膠回收目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，片段連入PMD18-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定，獲得序列后中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。發(fā)病癥狀描述接種蘋果殼囊孢后5d后，接種處呈現(xiàn)褐色壞死病斑、病健交界明顯、斑易剝離、內(nèi)部紅褐色、酒糟氣味，部分品種在接種處出現(xiàn)分生孢子器和分生孢子角。

（資料性）

蘋果品種抗腐爛病鑒定結(jié)果記錄蘋果品種抗腐爛病鑒定結(jié)果記錄表見表B.1。蘋果品種抗腐爛病鑒定結(jié)果記錄表編號(hào)品種名稱重復(fù)病情級(jí)別病情指數(shù)（DI）013579鑒定地點(diǎn)：鑒定人（簽字）：年月日接種日期：技術(shù)負(fù)責(zé)人（簽字）：年月日調(diào)查日期：

（資料性）

蘋果品種抗腐爛病鑒定結(jié)果報(bào)告單蘋果品種抗腐爛病鑒定結(jié)果報(bào)告單見表C.