《人肉瘤類器官》

團體標準

T/××××—××××

人肉瘤類器官

HumanSarcomaOrganoids

（征求意見稿）代替GB/T17608-1998

20×-××-××發(fā)布20×-××-××實施

中國抗癌協(xié)會發(fā)布

人肉瘤類器官

1范圍

本標準規(guī)定了人肉瘤類器官的倫理要求、技術(shù)要求和檢測方法。

本標準適用于患者來源肉瘤類器官的制備和檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文必不可少的條款。其中，注明日期的引用文

件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）

適用于本文件。

GB/T1.1-2020人類生物樣本保藏倫理要求

T/NAHIEM6醫(yī)學(xué)研究倫理委員會通用要求

全國臨床檢驗操作規(guī)程

WS213丙型肝炎診斷

WS293艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準

WS299乙型病毒性肝炎診斷標準

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

類器官Organoid

由成體干細胞或多能干細胞體外培養(yǎng)形成，可以自發(fā)進行自我更新、自組織、分化以形成與來源

組織高度相似的，具有一定空間結(jié)構(gòu)的體外3D細胞培養(yǎng)物。

3.2

2

腫瘤類器官TumoroidsorTumorOrganoids

由患者的腫瘤組織或其他含腫瘤細胞的樣本中提取的腫瘤細胞經(jīng)體外培養(yǎng)形成的，可以在體外擴

增并重現(xiàn)原始腫瘤病理形態(tài)、遺傳特征和治療反應(yīng)特征的類器官。

3.3

人肉瘤類器官HumanSarcomaOrganoids

人肉瘤類器官來源于骨腫瘤新鮮組織，具有自我更新、自我組裝的功能，并能代表體內(nèi)腫瘤的生

物學(xué)特征。

3.4

肉瘤類器官培養(yǎng)基CultureMediumofSarcomaOrganoids

能夠?qū)崿F(xiàn)體外模擬骨腫瘤細胞生長所需的微環(huán)境，誘導(dǎo)具有干性的細胞分化為各種類型的骨（腫

瘤）細胞，同時能夠持續(xù)維持干性細胞的特征，實現(xiàn)肉瘤類器官長期培養(yǎng)的介質(zhì)。

3.5

三維培養(yǎng)基質(zhì)膠Matrigel

三維培養(yǎng)基質(zhì)膠是有由層粘連蛋白、巢蛋白、硫酸膽囊素蛋白、IV型膠原等組成的一種細胞外基

質(zhì)，同時含有生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶。三維培養(yǎng)基質(zhì)膠能夠給類器官提供一定的孔隙和剛性的基

質(zhì)環(huán)境，幫助形成和維持穩(wěn)定的組織結(jié)構(gòu)，支持類器官的生長和分化，為肉瘤類器官的生長提供組織

支架。

3.6

傳代Passage

將生長密度為70-80%，且培養(yǎng)狀態(tài)良好的類器官采用物理吹打或者/和化學(xué)消化相結(jié)合的方法，

使其解離成類器官團或者/和單細胞懸液，按照一定比例稀釋后，重新接種于與原培養(yǎng)條件相同的體系

內(nèi)繼續(xù)進行培養(yǎng)和擴增。

3.7

3

凍存Cryopreservation

利用低溫降低類器官代謝，使細胞暫時停止生長，但又可以保持類器官的細胞活性和功能的低溫

保存過程。

3.8

復(fù)蘇Thawing/Recovering

將凍存在液氮或者-80℃冰箱中的類器官解凍后重新培養(yǎng)，細胞恢復(fù)生長的過程。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

DMSO:二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide）

DNA:脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

HBV:乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus）

HCV:丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus）

HIV:人免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus）

H&E：蘇木精-伊紅（HematoxylinandEosin）

mRNA:信使核糖核酸（MessengerRibonucleicacid）

PBS:磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate-bufferedsaline）

STR：短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemRepeat）

TB：結(jié)核病（Tuberculosis）

5倫理要求

5.1應(yīng)與類器官原組織供者簽署書面的合法有效的知情同意書，包括但不限于：合適條件下潛在研究

4

及治療的應(yīng)用、研究成果潛在的商業(yè)應(yīng)用及其他問題所適用的內(nèi)容。

5.2骨腫瘤組織樣本的處理和研究方案，應(yīng)獲得倫理審查委員會審查通過。

5.3應(yīng)對類器官原組織供者個人信息進行隱私保護。

6技術(shù)要求

6.1類器官形態(tài)

光學(xué)顯微鏡下觀察人肉瘤類器官，應(yīng)具備邊緣清晰、透亮的狀態(tài)?？煽吹筋惼鞴儆啥鄠€細胞組合

而成，呈現(xiàn)出致密球狀體特征。部分類器官可見中間空腔，空腔及與外界交界處邊緣清晰，細胞透亮。。

6.2類器官構(gòu)建及生長

6.2.1從骨腫瘤患者來源的人骨腫瘤組織或細胞，初次在體外構(gòu)建成類器官后，需要滿足在體外能夠

穩(wěn)定傳代至少3代。

6.2.2傳代后的類器官，應(yīng)能進行體外重建成為新的類器官，重建的類器官應(yīng)與傳代之前代次的類器

官形態(tài)等特征維持一致。

6.3類器官細胞存活率

凍存和復(fù)蘇的類器官存活率均應(yīng)不低于50%，且存活的類器官在體外可以持續(xù)進行類器官傳代、

凍存和復(fù)蘇。

6.4微生物

真菌、細菌、支原體、HBV、HCV、HIV和外源病毒因子等應(yīng)為陰性。

6.5STR

對體外構(gòu)建成功的類器官進行STR檢測及分型鑒定，應(yīng)與供體STR檢測結(jié)果一致。

6.6病理形態(tài)

6.6.1類器官以及來源組織同時進行HE染色后，由具備病理鑒定資質(zhì)的專業(yè)人員進行判定，其組成

細胞應(yīng)具有腫瘤細胞相關(guān)的異型性特征（如：核深染、核分裂異常、核質(zhì)比例異常等）。

6.6.2對體外構(gòu)建成功的類器官進行免疫組化染色，檢測結(jié)果應(yīng)與來源腫瘤組織的結(jié)果維持一致，肉

瘤類器官的免疫組化標志物可參考Osteocalcin、Vim、SOX9、S100、Actin、SMA、CK、NSE、CD99、

5

SATB2、MDM2、CDK4、Ki67及P53進行選擇。

6.7遺傳特征和染色體核型

對體外構(gòu)建成功的類器官進行基因組測序（如：WES），檢測結(jié)果應(yīng)與來源腫瘤組織的基因突變

結(jié)果維持一致。

6.8成瘤

將體外構(gòu)建成功的肉瘤類器官，經(jīng)皮下接種于免疫缺陷小鼠脅腹部，觀察其成瘤能力。

7檢測方法

7.1類器官形態(tài)結(jié)構(gòu)

體外構(gòu)建三維肉瘤類器官，使用倒置顯微鏡觀察。按照附錄B的方法進行檢測。

7.2類器官數(shù)量

通過倒置顯微鏡，對成功構(gòu)建的肉瘤類器官進行拍照并記錄，使用顯微鏡自帶的標尺對類器官大

小進行測量，類器官數(shù)量可以直接進行計數(shù)。

7.3類器官細胞存活率

對包括培養(yǎng)中、復(fù)蘇、傳代和凍存的類器官進行類器官細胞活性檢測。存活率可按照附錄A檢

測。

7.4微生物

7.4.1細菌及真菌

按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”檢測。

7.4.2支原體

按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3301支原體檢查法”檢測。

7.4.3外源病毒因子

6

按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3302外源病毒因子檢查法”檢測。

7.4.4HIV

按照WS293核酸法檢測

7.45HBV

按照WS299核酸法檢測

7.46HCV

按照WS213核酸法檢測。

7.5STR

按照附錄C檢測。

7.6病理特征

按照附錄B檢測。

7.7遺傳特征

按照附錄B檢測。

7.8成瘤鑒定

人源性肉瘤類器官接種動物后在注射部位和（或）轉(zhuǎn)移部位由接種細胞本身形成腫瘤的能力-即

接種的細胞自身形成腫瘤的能力。

7

附錄A

（資料性）

肉瘤類器官培養(yǎng)的主要試劑材料與操作要點

A.1主要試劑材料

A.1.1類器官培養(yǎng)基主要成分

表A.1肉瘤類器官培養(yǎng)基主要成分表

組分人肉瘤類器官

AdvanceDMEM-F12√

HEPES√

Glutamax√

P/S√

A83-01√

B27√

EGF√

FGF-10√

Forskolin√

N2√

Noggin√

R-Spondin-1√

Y-27632√

A.1.2類器官培養(yǎng)三維支架材料

三維支架材料為取自基底膜的支持性凝膠，主要由層粘連蛋白、巢蛋白、硫酸膽囊素蛋白、IV型

膠原等組成，同時還含有生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等?；|(zhì)膠在4℃時為液態(tài)，室溫條件下聚合形

成具有生物學(xué)活性的三維支架結(jié)構(gòu)，模擬細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能，有利于肉瘤類

器官的培養(yǎng)和分化。

A.1.3組織消化酶

骨腫瘤組織消化所用的消化酶一般由IV型膠原酶、DNA酶和透明質(zhì)酸酶構(gòu)成。其作用是水解

8

細胞外基質(zhì)和膠原蛋白等成分，使骨腫瘤細胞從組織中完全分離出來。消化條件為37℃恒速水平搖

床，時間不超過1小時，可在消化中途取上清液置于鏡下觀察，出現(xiàn)3-10個的細胞團形成，則終止

消化。

A.1.4類器官凍存液

類器官凍存液為無血清凍存液，一般含有10%的二甲基亞砜（DMSO）。

A.2類器官構(gòu)建步驟

A.2.1組織的清洗

將組織樣本放入裝有清洗液的10cm細胞培養(yǎng)皿中，用刀片或眼科鑷子和剪刀去除壞死、鈣化組

織和脂肪組織（非脂肪組織樣本）。隨后將組織樣本放入15mLFalcon離心管，加入清洗液洗滌組織

樣本，洗滌次數(shù)不少于3次，每次洗滌時間不少于1min。

A.2.2組織細胞的消化

將組織轉(zhuǎn)移到適量容積的收集管中（如：1.5mLEP管、5mL或者15mLFalcon管），用眼科剪

和鑷子將組織剪成1-2mm3的立方體碎片并混懸于適量的組織消化緩沖液中，37°C孵育15–60min。

當組織已解離至>70%為單細胞時，加入不少于消化液體積的終止液。

A.2.3組織樣本消化后處理

a）如果沉淀有明顯絮狀物：

加入適量DNaseI（1mg/mL），在37°C水浴中孵育3-5min后加入不少于消化液體積的清洗液終

止消化。

b）如消化的組織液中含有較多的結(jié)締組織：

依次用100μm和70μm的細胞篩過濾組織液，以去除大的結(jié)締組織碎片，收集濾過液。

c）如果沉淀有明顯紅色：

加入1mLRBC裂解緩沖液，在冰中孵育1-2min裂解紅細胞后，加入不少于消化液體積的清洗

液終止消化。

A.2.4類器官接種培養(yǎng)物的制備

加入適量清洗液重懸細胞沉淀，制成均一的細胞懸液，用自動細胞計數(shù)器計數(shù)細胞：取10μL細

胞懸液采用Cytosmart、Countstar等全自動細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)，評估樣本質(zhì)量，為細胞接種計

9

劃提供參考依據(jù)。

A.2.5類器官培養(yǎng)物的種板

將細胞沉淀置于冰上，加入適量體積的冰冷Matrigel，輕輕重懸細胞沉淀并混勻，以每孔1-5×104

細胞密度進行接種，避免產(chǎn)生氣泡；將種有Matrigel和細胞的48孔板置于37°C培養(yǎng)箱中，靜置5-

15min，待Matrigel固化后每孔添加300μL類器官完全培養(yǎng)基（圖一）。

圖一：肉瘤類器官構(gòu)建流程

A.3類器官傳代、凍存與復(fù)蘇

A.3.1類器官傳代

選擇生長密度為70-80%的類器官進行傳代。根據(jù)前一代類器官培養(yǎng)孔內(nèi)的生長個數(shù)和大小綜合

考慮傳代密度，一般以前一代密度的20-30%為宜。重要的類器官可以每1-2周以1:2-1:6的比例傳代

一次。相關(guān)實驗試劑和操作方法見圖二。

10

A.3.2類器官凍存

類器官通常在擴增到>5×105個細胞數(shù)后被凍存，通常需要2-4周的培養(yǎng)時間，傳2-4代。將暫不

使用的類器官，加入凍存液后緩慢降溫，放入液氮或-80℃冰箱低溫保存。將凍存管放入冷凍容器中

（如梯度降溫盒MrFrosty），放置-80℃超低溫冰箱存儲過夜。次日轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。相關(guān)實驗試

劑和操作方法見圖二。

圖二：肉瘤類器官凍存與傳代流程

A.3.3類器官復(fù)蘇

類器官復(fù)蘇遵循快融原則。使用37℃水浴孵育1-3min使其盡快融化，使用至少1-5倍體積的無

血清培養(yǎng)基稀釋凍存液，離心后選擇合適的培養(yǎng)基進行類器官的培養(yǎng)及傳代。根據(jù)細胞計數(shù)情況，添

加適量基質(zhì)膠使細胞終濃度為0.5-3×104個/10μL，進行細胞接種。

11

A.4肉瘤類器官培養(yǎng)操作要點

A.4.1類器官防污染處理

組織樣本在取材及運輸過程中可能會被污染，因此取材時應(yīng)予注意，應(yīng)將樣本放在含有雙抗的組

織運送液中。組織處理過程要注意無菌操作，組織消化時也可以在消化液中加入抗生素防止污染。

類器官培養(yǎng)過程若發(fā)生污染，則應(yīng)丟棄培養(yǎng)板。丟棄前應(yīng)進行無害化處理。

A.4.2類器官傳代注意事項

解凍后的類器官應(yīng)先進行2次傳代后再進行實驗。解凍后，類器官通常在7-14天后可以進行傳

代（圖二）。

A.4.3類器官凍存注意事項

將類器官在4℃、200g條件下離心5min。棄上清后加入適量（0.5-1mL）無血清類器官凍存液輕

輕完全混勻。將重懸后的類器官轉(zhuǎn)移到標注好的凍存管中，將凍存管放入凍存盒中，放入-80℃冰箱緩

慢降溫，過夜之后將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮中長期保存（圖二）。

A.4.4類器官復(fù)蘇注意事項

37℃水浴條件進行類器官的解凍過程。當凍存培養(yǎng)液變?yōu)橐后w時解凍完成，此時肉眼可觀察到類

器官沉降于凍存管底部。水浴時間約為2-3min，溫度過高或水浴時間過長會影響解凍后類器官的生

長。類器官解凍完成后應(yīng)立即開始下一步，以免影響細胞活力。不建議將類器官暴露于反復(fù)的冷凍-解

凍循環(huán)中（圖二）。

12

附錄B

（資料性）

肉瘤類器官的鑒定

B.1類器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察（細胞水平）

將類器官培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下，在10倍視野下觀察并計數(shù)類器官。生長活力好的類器官直

徑約為30-100μm。以常規(guī)HE染色進行肉瘤類器官形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：肉瘤類器官構(gòu)建成功后，制備冰

凍或石蠟切片，通過HE染色進行形態(tài)學(xué)鑒定。

B.2腫瘤標志物的染色鑒定（蛋白水平）

類器官成構(gòu)建立后，制備石蠟包埋或冰凍切片，通過免疫熒光或者免疫組化染色進行生物標志物

檢測，確定類器官與來源組織具有相似的蛋白表達趨勢。骨腫瘤可差異性表達Osteocalcin、Vim、SOX9、

S100、Actin、SMA、CK、NSE、CD99、SATB2、MDM2、CDK4、Ki67及P53。

類器官整體染色：培養(yǎng)大小約100-200μm的類器官，加入類器官收集液，置于冰上放置1h以溶

解基質(zhì)膠，600r/min離心2次。加入0.125%TritonX-100破膜液，室溫作用10min，用血清（10%二

抗血清）封閉1h。根據(jù)不同稀釋比配制一抗，滴加一抗，4°C孵育過夜。不同組別分別滴加各種熒光

標記的二抗，室溫避光作用1h。PBS漂洗3次后加入DAPI染核液，室溫作用10min后PBS漂洗3

次。加入水性封片劑，避光濕盒保存，共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

類器官免疫組化染色：1）脫蠟：a）將待檢測石蠟組織片置于耐高溫塑料染色架，65℃烘烤30

min；b）二甲苯Ⅰ脫蠟15min；（c）二甲苯ⅠI脫蠟10min。2）水化：切片依次浸入無水乙醇Ⅰ、無水

乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、流動的自來水水，分別洗滌3-5min。然后，將

片子浸泡在自來水中，靜置10min。3）抗原修復(fù)：將片子浸泡在修復(fù)液中，采用加熱的方式使抗原

修復(fù)液保持微沸狀態(tài)，加熱20min。4）熱修復(fù)結(jié)束取出放置實驗臺，靜置，自然冷卻至室溫，流動

的自來水洗滌3~5min。5）內(nèi)源性過氧化物酶阻滯劑去除組織片內(nèi)源性過氧化物酶。PBS洗滌3次，

每次3min。6）封閉：添加動物非免疫羊血清，室溫靜置20min。7）一抗孵育：添加一抗，放入濕

盒，置于2~8℃冰箱孵育過夜。8）次日，從2~8℃冰箱中取出濕盒，放置實驗臺，室溫靜置45min。

9）0.05%PBST洗滌三次，每次3min。10）二抗孵育：添加二抗，放入濕盒，室溫靜置、避光孵育30

min。11）重復(fù)步驟9。12）DAB顯色。13）蘇木素染色液染色1min，流動的自來水洗滌3～5min。

14）1‰鹽酸溶液浸泡30sec，流動的自來水洗滌3~5min。15）飽和碳酸鋰溶液浸泡30sec，流動的

自來水洗滌3-5min。16）切片依次浸入50%乙醇、75%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇I、無

13

水乙醇II進行梯度脫水，分別洗滌3-5min。17）透明：切片依次浸入二甲苯I5min、二甲苯II5min。

18）樹膠封片：將透明好的片子平穩(wěn)擺放，用巴氏吸管吸取適量中性樹膠滴加在樣本上，蓋上蓋玻片

輕壓四角使得樹膠均勻擴散。19）晾片：將封片完成的玻片放置在開啟的通風(fēng)櫥內(nèi)，靜置過夜以便二

甲苯充分揮發(fā)。20）上機檢測，整理數(shù)據(jù)并填寫檢測結(jié)果。

B.3基因表達變化及基因突變分析（基因水平）

對構(gòu)建成功的第4代或第5代肉瘤類器官，進行基因組測序（如：WES），比較類器官基因突變

譜與來源組織的差異。肉瘤類器官與來源組織存在相同的基因突變位點，在基因水平重現(xiàn)了來源組織

的多樣性和復(fù)雜性，不會出現(xiàn)均一化的基因突變現(xiàn)象。

B.4體外藥敏檢測（功能應(yīng)用）

利用肉瘤類器官模型，完成抗腫瘤藥物的體外敏感性評價。將患者體內(nèi)的腫瘤組織（細胞）復(fù)制

到體外，建立多個腫瘤類器官平行樣本，驗證所構(gòu)建類器官的生物學(xué)功能；同時在體外進行藥物敏感

性測試，用于預(yù)測臨床藥物的療效/指導(dǎo)腫瘤精準化治療。

14

附錄C

（資料性）

短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）檢測

類器官DNA的提?。?/p>

待類器官生長至Matrigel體積的80%左右，棄上清。加入500μLPBS清洗1次。吸去PBS后加

入250μLTryple，用移液槍將基質(zhì)膠輕輕打散。5-10min