黃曲霉毒素測定的其他方法-高效液相色譜-柱前衍生法

黃曲霉毒素測定的其他方法——高效液相色譜-柱前衍生法1.原理試樣中的黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2,用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取,提取液經(jīng)黃曲霉毒素固相凈化柱凈化去除脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干擾物質(zhì),凈化液用三氟乙酸柱前衍生,液相色譜分離,熒光檢測器檢測,外標法定量。2.試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的一級水。2.1試劑甲醇(CH3OH):色譜純，乙腈(CH3CN):色譜純，正已烷(C6H14):色譜純，三氟乙酸(CF3COOH)。2.2試劑配制乙腈-水溶液(84+16):取840mL乙腈加人160mL水。甲醇-水溶液(70+30):取700mL甲醇加入300mL水。乙腈-水溶液(50+50):取500mL乙腈加人500mL水。乙腈-甲醇溶液(50+50):取500mL乙腈加入500mL甲醇。2.3標準品AFTB1標準品(C17H12O6,CAS號:1162-65-8):純度≥98%,或有證的標準物質(zhì)。AFTB2標準品(C17H14O6,CAS號:7220-81-7):純度≥98%,或有證的標準物質(zhì)。AFTG1標準品(C17H12O7,CAS號:1165-39-5):純度≥98%,或有證的標準物質(zhì)。AFTG2標準品(C17H14O7,CAS號:7241-98-7):純度≥98%,或有證的標準物質(zhì)。注:標準物質(zhì)可以使用滿足溯源要求的商品化標準溶液。2.4標準溶液配制標準儲備溶液(10μg/mL):分別稱取AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG21mg(精確至0.01mg),用乙腈溶解并定容至100mL。此溶液濃度約為10μg/mL。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后,在-20℃下避光保存,備用。臨用前進行濃度校準(校準方法參見附錄A)?；旌蠘藴使ぷ饕?AFTB1和AFTG1:100ng/mL,AFTB2和AFTG2:30ng/mL):準確移取AFTB1和AFTG1標準儲備溶液各1mL,AFTB2和AFTG2標準儲備溶液各300μL至100mL容量瓶中,乙腈定容。密封后避光-20℃下保存,三個月內(nèi)有效。標準系列工作溶液:分別準確移取混合標準工作液10μL、50μL、200pμL、500μL、1000μL、2000μL、4000μL至10mL容量瓶中，用初始流動相定容至刻度(含AFTB1和AFTG1濃度為0.1ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL,AFTB2和AFTG2濃度為0.03ng/mL、0.15ng/mL、0.6ng/mL、l.5ng/mL、3.0ng/mL、6.0ng/mL、12ng/mI的系列標準溶液)。3.儀器和設(shè)備勻漿機，高速粉碎機，組織搗碎機，超聲波/渦旋振蕩器或搖床。天平:感量0.01g和0.00001g。渦旋混合器，高速均質(zhì)器:轉(zhuǎn)速6500r/min~24000r/min。離心機:轉(zhuǎn)速≥6000r/min，氮吹儀。玻璃纖維濾紙:快速、高載量、液體中顆粒保留1.6μm。液相色譜儀:配熒光檢測器。色譜分離柱。篩網(wǎng):1mm~2mm試驗篩孔徑。黃曲霉毒素專用型固相萃取凈化柱(以下簡稱凈化柱),或相當者。一次性微孔濾頭:帶0.22μm微孔濾膜(所選用濾膜應采用標準溶液檢驗確認無吸附現(xiàn)象,方可使用)。恒溫箱，pH計。4.分析步驟4.1樣品制備【液體樣品】(植物油、醬油、醋等)采樣量需大于1L,對于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個包裝(同一批次或號),將所有液體樣品在一個容器中用勻漿機混勻后,取其中任意的100g(mL)樣品進行檢測?！竟腆w樣品】(谷物及其制品、堅果及籽類、嬰幼兒谷類輔助食品等)采樣量需大于1kg,用高速粉碎機將其粉碎,過篩,使其粒徑小于2mm孔徑試驗篩,混合均勻后縮分至100g,儲存于樣品瓶中,密封保存,供檢測用。【半流體】(腐乳、豆豉等)采樣量需大于1kg(L),對于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個包裝(同一批次或號),用組織搗碎機搗碎混勻后,儲存于樣品瓶中,密封保存,供檢測用。4.2樣品提取4.2.1液體樣品4.2.1.1植物油脂稱取5g試樣(精確至0.01g)于50mL離心管中,加入20mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),渦旋混勻,置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min(或用均質(zhì)器均質(zhì)3min),在6000r/min下離心10min,取上清液備用。4.2.1.2醬油、醋稱取5g試樣(精確至0.01g)于50mL離心管中,用乙腈或甲醇定容至25mL(精確至0.1mL),渦旋混勻,置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min(或用均質(zhì)器均質(zhì)3min),在60O0r/min下離心10min(或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾),取上清液備用。4.2.2固體樣品4.2.2.1一般固體樣品稱取5g試樣(精確至0.01g)于50mL離心管中,加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min(或用均質(zhì)器均質(zhì)3min),在6000r/min下離心10min(或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾),取上清液備用。4.2.2.2嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品稱取5g試樣(精確至0.01g)于50mL離心管中,加入20.0mL乙腈-水溶液(50+50)或甲醇-水溶液(70+30),渦旋混勻,置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min(或用均質(zhì)器均質(zhì)3min),在6000r/min下離心10min(或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾),取上清液備用。4.2.3半流體樣品稱取5g試樣(精確至0.01g)于50mL離心管中,加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min(或用均質(zhì)器均質(zhì)3min),在6000r/min下離心10min(或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾),取上清液備用。4.3樣品黃曲霉毒素固相凈化柱凈化移取適量上清液,按凈化柱操作說明進行凈化,收集全部凈化液。4.4衍生用移液管準確吸取4.0mL凈化液于10mL離心管后在50℃下用氮氣緩緩地吹至近干,分別加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸,渦旋30s,在40℃±1℃的恒溫箱中衍生15min,衍生結(jié)束后,在50℃下用氮氣緩緩地將衍生液吹至近干,用初始流動相定容至1.0mL,渦旋30s溶解殘留物,過0.22μm濾膜,收集濾液于進樣瓶中以備進樣。4.5色譜參考條件色譜參考條件列出如下:a)流動相:A相:水,B相:乙腈-甲醇溶液(50+50);b)梯度洗脫:24%B(0min~6min),35%B(8.0min~10.0min),100%B(10.2min~11.2min),24%B(11.5min~13.0min);c)色譜柱:C8柱(柱長150mm或250mm,柱內(nèi)徑4.6mm,填料粒徑5.0μm),或相當者;d)流速:1.0mL/min;e)柱溫:40℃;f)進樣體積:50μL;g)檢測波長:激發(fā)波長360nm;發(fā)射波長440nm;h)液相色譜圖:參見圖D.1。4.6樣品測定4.6.1標準曲線的制作系列標準工作溶液由低到高濃度依次進樣檢測,以峰面積為縱坐標-濃度為橫坐標作圖,得到標準曲線回歸方程。4.6.2試樣溶液的測定待測樣液中待測化合物的響應值應在標準曲線線性范圍內(nèi),濃度超過線性范圍的樣品則應稀釋后重新進樣分析。4.6.3空白試驗不稱取試樣,按4.2、4.3和4.4的步驟做空白實驗。應確認不含有干擾待測組分的物質(zhì)。5.分析結(jié)果的表述試樣中AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的殘留量按下式計算:式中:X——試樣中AFTB1、AFTB2.、AFTG1或AFTG2的含量,單位為μg/kg;ρ——進樣溶液中AFTB1、AFTB2、AFTG1,或AFTG2按照外標法在標準曲線中對應的濃度,單位為ng/mL;V1——試樣提取液體積(植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積;醬油、醋按定容總體積)，單位為mL;V3——凈化液的最終定容體積,單位為mL;100O——換算系數(shù);V2——凈化柱凈化后的取樣液體積,單位為mL;m——試樣的稱樣量,單位為g。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。6.精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。7.其他當稱取