2019醫(yī)學(xué)12核酸類藥物學(xué)習(xí)課件

第十二章核酸類藥物

第一節(jié)核酸類物質(zhì)的分離提取及其發(fā)酵生產(chǎn)

一、RNA與DNA的提取與制備（一）RNA的提取與制備1、工業(yè)用RNA的提?。?）RNA及其工業(yè)來源從微生物中提取RNA是工業(yè)上最實(shí)際和有效的方法。一些最常見的菌體含有豐富的核酸資源，如酵母、白地霉、多種抗菌素的菌絲體——青霉素，制霉菌素等菌體。

通常在細(xì)菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。

在菌體內(nèi)RNA含量的變化受培養(yǎng)基組成影響，其中關(guān)鍵是銨離子濃度和磷酸鹽濃度。培養(yǎng)酵母菌體收率高，易于提取RNA。

很顯然在許多酵母中，早期細(xì)胞中的RNA含量高，其確切數(shù)值取決于碳、氮比例和培養(yǎng)基組成等。（2）高RNA含量酵母菌株的篩選可以從自然界篩選到RNA含量高的酵母菌株，也可用誘變育種的方法提高酵母菌的RNA含量。稀堿法：是用氫氧化鈉溶液（1%），使細(xì)胞壁變性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。需用酸中和pH7。然后除去菌體，將pH調(diào)至RNA的等電點(diǎn)（pH2.5），使RNA沉淀出來。上法的缺點(diǎn)是制得的RNA

Mr較低,(磷酸單脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90℃保持3~4h破壞酶)。

濃鹽法：是用高濃度鹽溶液（6%~8%）處理，同時(shí)加熱，以改變細(xì)胞壁的通透性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。

要避免分子降解，可采用苯酚法制備RNA。用苯酚處理生物材料，使蛋白質(zhì)變性，然后離心，上層水溶液內(nèi)含有全部RNA，可用乙醇沉淀出來。

脫氧核糖核蛋白溶于濃鹽溶液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L鹽溶液。（4）RNA的提取實(shí)例：啤酒酵母是提取RNA的很好的資源。取100g壓榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH

3g的水，20℃以下緩慢攪拌30分鐘。用6mol／LHCl調(diào)至pH7，攪拌15分鐘，離心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol／LHCl調(diào)pH2.5，置冷過夜，離心得RNAl.8g（純度80％）。

（二）DNA的提取與制備1．工業(yè)用DNA的提取取新鮮冷凍魚精20kg，用絞肉機(jī)粉碎2次成漿狀，加入等體積水，攪拌均勻，傾入反應(yīng)鍋內(nèi)，緩慢攪拌，升溫至100℃，保溫15分鐘，迅速冷卻至20～25℃，離心除去魚精蛋白等沉淀物，獲得35L含熱變性DNA的溶液，經(jīng)精確測定DNA含量后直接可用于酶法降解生產(chǎn)脫氧核苷酸。如要制成固體狀DNA，在熱變性DNA溶液中逐漸加入等體積95％乙醇，離心可獲得纖維狀DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗滌，減壓低溫干燥得DNA粗品，產(chǎn)品含熱變性DNA50％～60％。2、具有生物活性DNA的制備動(dòng)物內(nèi)臟（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理鹽水經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎1分鐘，勻漿于2500r／pm離心30分鐘，沉淀用同樣體積的生理鹽水洗滌3次，每次洗后離心，將沉淀懸浮于20倍重量的冷生理鹽水中，再搗碎3分鐘，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶劑）十二烷基磺酸鈉，并攪拌2～3小時(shí)，在0℃2500r／pm離心，在上層液中加入等體積的冷95％乙醇，離心即可得到纖維狀DNA，再用冷乙醇和丙酮洗滌，減壓低溫干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于適量蒸餾水，加入5％十二烷基磺酸鈉達(dá)1／10體積，攪拌1小時(shí)，經(jīng)5000r／pm離心1小時(shí)，清液中加入NaCl達(dá)1mol／L，再緩慢加入冷95%乙醇，DNA析出，經(jīng)乙醇、丙酮洗滌，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制備需在0～3℃操作）。二、用酶解法、發(fā)酵法和半合成法制備核苷酸

（一）酶解法及堿水解法制備核苷酸1、酶解法制備脫氧核苷酸桔青霉產(chǎn)生5`-磷酸二脂酶

紅酵母產(chǎn)生3`-磷酸二脂酶

2、酶解法制備戊糖核苷酸

我國從60年代開始使用核酸酶P1降解核糖核酸生產(chǎn)單核苷酸，日本年產(chǎn)呈味核苷酸（肌苷酸和鳥苷酸）3000噸，其中60%是使用酶解法生產(chǎn)的。酶解法生產(chǎn)5‘—單核苷酸工藝流程3、雙酶法生產(chǎn)肌苷酸和鳥苷酸（I＋G）

呈味核苷酸的主要品種是肌苷酸鈉和鳥苷酸鈉，商品名簡稱為（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可獲得GMP和AMP，其中AMP經(jīng)脫氨生成IMP。雙酶法生產(chǎn)（I十G）工藝。4．菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸

磷酸二酯酶在合適的條件下降解細(xì)胞內(nèi)的RNA可產(chǎn)生5′-核苷酸。在國內(nèi)用谷氨酸產(chǎn)生菌體自溶法生產(chǎn)5‘-核苷酸。（1）菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸工藝流程：5．堿水解法生產(chǎn)2＇，3＇-混合核苷酸

RNA結(jié)構(gòu)中的磷酸二酯鍵對于堿性條件不穩(wěn)定，很容易生成2′，3-環(huán)狀磷酸酯，此環(huán)狀磷酸酯對堿更不穩(wěn)定，很易加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。取RNA配成3％～3.5%的水溶液，加氫氧化鈉達(dá)0.3mol／L濃度，升溫至38℃，保溫16～20小時(shí)，用6mol／L鹽酸中和至pH7.0，從RNA水解成2′，3＇-核苷酸的降解率達(dá)95％以上，將2′，3＇-混合核苷酸制成每片含50～100mg的片劑，經(jīng)臨床使用，對非特異性血小板減少癥、對白血球減少癥、癌腫的化療和放療后的升白血球均有較好療效。（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸1．發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸（IMP）2、發(fā)酵生產(chǎn)黃苷酸（XMP）及酶法轉(zhuǎn)化成鳥苷酸（三）半合成法制備核苷酸由于發(fā)酵法生產(chǎn)核苷的產(chǎn)率很高，核苷懸浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷卻條件下加入氯化氧磷，進(jìn)行磷酸化，從核苷生成5′-核苷酸收率可達(dá)90%。例一：肌苷2mmol／L懸浮于5ml磷酸三乙酯中，溫度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmol／L，反應(yīng)2h，5＇-IMP摩爾產(chǎn)率達(dá)91％。例二：鳥苷2mmol／L懸浮于5ml磷酸三甲酯中，溫度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmo/L，反應(yīng)6h，5＇-GMP摩爾產(chǎn)率達(dá)90%。三、核苷的制備本節(jié)敘述核苷的化學(xué)法和發(fā)酵法生產(chǎn)。（－）RNA化學(xué)水解法制備核苷1．核苷生產(chǎn)工藝流程RNA經(jīng)甲酰胺化學(xué)水解制備核苷（－）RNA化學(xué)水解法制備核苷1．核苷生產(chǎn)工藝流程（圖14·8）（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷發(fā)酵法生產(chǎn)核苷是近代發(fā)酵工程領(lǐng)域中的杰出成果，產(chǎn)率高，周期短，控制容易，產(chǎn)量大。用發(fā)酵法生產(chǎn)各種核苷的菌株有著許多共同特點(diǎn)：①它們都使用磷酸單酯酶活力很強(qiáng)的枯草芽孢桿菌或短小芽抱桿菌為誘變出發(fā)菌株；②它們都是通過使用物理或化學(xué)誘變方法選育出在遺傳性狀上具有特定標(biāo)記的誘變菌；③它們在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)必須提供限量的生長因素，并且好氧，在某一特定的范圍內(nèi)累積大量核苷。1．發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷(枯草桿菌)2、發(fā)酵法生產(chǎn)鳥苷和黃苷(肌苷產(chǎn)生菌)3、發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷(產(chǎn)氨短桿菌)

第二節(jié)核酸類藥物

核酸類藥物可分兩大類。一類為具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)，這些品種都是生物體合成的原料，或是蛋白質(zhì)、脂肪、糖生物合成、降解以及能量代謝的輔酶。缺乏這類物質(zhì)會(huì)使生物體代謝造成障礙，發(fā)生病態(tài)。提供這一類藥物，有助于改善機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量平衡，加速受損組織的修復(fù)，促使缺氧組織恢復(fù)正常生理機(jī)能。第二類為自然結(jié)構(gòu)堿基、核苷、核苷酸結(jié)構(gòu)的類似物或聚合物，這一類核酸類藥物是當(dāng)今人類治療病毒、腫瘤、艾滋病的重要手段，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制的臨床藥物。

第二類核酸類藥物大部分由自然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)進(jìn)行半合成為結(jié)構(gòu)改造物，近年來發(fā)展為化學(xué)-酶合成法。大大提高收率，降低成本。一、疊氮胸苷（Azidothymidine，AZT）（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

AZT是1987美國FDA批準(zhǔn)的治療艾滋病的新藥。AZT的藥理作用是人體內(nèi)經(jīng)磷酸化后生成了3`-疊氮-2′-脫氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸參與病毒DNA的合成，含有AZT成份的DNA不能繼續(xù)復(fù)制，從而達(dá)到阻止病毒增殖的目的。（二）生產(chǎn)工藝此合成路線的起始原料是胸苷，目前主要是從DNA水解法制備，由于原料來源少，合成路線較復(fù)雜，成本很高。已見報(bào)道的胸苷合成方法還有兩條途徑：

①從2′-脫氧胞苷或2′-脫氧鳥苷或2＇-脫氧腺苷與胸腺嘧啶反應(yīng)，經(jīng)大腸桿菌產(chǎn)生的磷酸化酶催化生成胸苷。

②從鳥苷（300mmol／L）與胸腺嘧啶（300mmol／L）反應(yīng)，在歐文氏菌AJZ992所產(chǎn)生的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的催化下生成5′-甲基尿苷，然后經(jīng)化學(xué)法合成胸苷。二、阿糖腺苷Adeninearabinoside（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

阿糖腺苷的化學(xué)名稱為9-β-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或稱腺嘌呤阿拉伯糖苷。早在1960年就在實(shí)驗(yàn)室合成了阿糖腺苷，1969年美國用StreptomycesantibioticusNRRL3238菌株，1972年日本用Strepto－myceshebacecus4334菌株發(fā)酵法分別制備了阿糖腺苷。

1979年用從E．Coli中分離得到的尿嘧啶磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶，以固相酶的方法將阿糖脲苷轉(zhuǎn)化為阿糖腺苷。（二）生產(chǎn)工藝1、酶-化學(xué)合成法最新的阿糖腺苷的合成法是酶-化學(xué)合成法：用尿苷為原料經(jīng)氧氯化磷和二甲基甲酰胺反應(yīng)，生成氧橋化合物，在堿性水溶液中水解成阿糖尿苷，然后利用阿糖尿苷中的阿拉伯糖經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化成阿糖腺苷。經(jīng)選育從阿糖尿苷酶法合成阿糖腺苷的優(yōu)秀菌株是產(chǎn)氣腸桿菌（Enterbacteraerogens），這株菌能產(chǎn)生尿苷磷酸化酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶（Pynpase），用這個(gè)菌株的休止細(xì)胞作為酶源，從阿糖尿苷和腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷，菌體也可制成固定化細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。2、以5`-AMP為原料的化學(xué)合成（三）作用與用途阿糖腺苷是近年來引人注目的廣譜DNA病毒抑制劑，對單純皰疹Ⅰ、Ⅱ型，帶狀皰疹，巨細(xì)，牛痘等DNA病毒，在體內(nèi)外都有明顯抑制作用。目前認(rèn)為，阿糖腺苷是治療單純皰疹腦炎最好的抗病毒藥物。阿糖腺苷在體內(nèi)受激酶作用生成的阿糖腺三磷，是脫氧腺三磷（dATP）的拮抗物，從而阻抑了以dATP為底物的病毒DNA聚合酶的活力。而且阿糖腺三磷對于病毒DNA聚合酶的親和性比宿主細(xì)胞的同一個(gè)酶的親和性高。因此這個(gè)藥物對于抑制病毒具有較高選擇性。

三、三氮唑核苷（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)三氮唑核苷商品名病毒唑，對DNA病毒，RNA病毒都有廣泛作用。本品為白色結(jié)晶，熔點(diǎn)174～176℃，易溶于水。這個(gè)化合物經(jīng)X線解析，它的立體結(jié)構(gòu)與腺苷、鳥苷非常類似，在體內(nèi)被磷酸化成三氮唑核苷酸，抑制肌苷酸脫氫酶阻斷鳥苷酸的生物合成，從而抑制病毒DNA合成。它的另一特點(diǎn)是對病毒作用點(diǎn)多，不易使病毒產(chǎn)生抗藥性。

（二）生產(chǎn)工藝

酶合成法使用產(chǎn)氣腸桿菌，以（尿苷）肌苷和TCA為底物可以用酶法簡易地合成三氮唑核苷采用前段與后段由兩個(gè)不同的酶催化，即前段使用嘧啶核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶。四、阿糖胞苷（Cytarabine，Cytosinearabinoside，ArabinosylCytosine，Aracytidine）

（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

阿糖胞苷又稱胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的組成部分是阿拉伯糖。白色或類自色結(jié)晶性粉末，無臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中極微溶。阿糖胞苷進(jìn)入體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榘⑻前账?，抑制DNA聚合酶，阻止胞二磷轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗醢讖亩种艱NA的合成，干擾DNA病毒繁殖和腫瘤細(xì)胞增殖。只能注射。

（二）生產(chǎn)工藝1．以5＇－CMP為原料的合成法（1）工藝路線：2、工藝過程：

①水解：并加入處理好的6.5L氫氧化鑭凝膠，總體積為7.5L，升溫至90℃，在不斷攪拌下，于pH9下進(jìn)行水解。在不同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，均勻取出2mL凝膠溶液，離心分離，取上清液5至10μl，pH9.2電泳分析，檢查水解程度。②氧橋化：氧橋化后總OD光譜高峰位置移至264nm（pH2）③氨解：使氧橋斷裂3‘，5’-乙酰基脫落。④成鹽：2％鹽酸-甲醇2、以葡萄糖酸鈣為原料的合成路線

五、聚肌胞苷酸（聚肌胞）（Poyinosinic，PolycytidylicAcid，Poly1：C）（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1967年美國人Field發(fā)現(xiàn)聚肌胞是干擾素誘導(dǎo)物，而且具有廣譜抗病毒作用。本品是人工合成的干擾素誘導(dǎo)劑，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸組成的雙股多聚核苷酸。本品可溶于0.85％氯化鈉溶液。（二）生產(chǎn)工藝70年代中期我國開始研制聚肌胞，其生產(chǎn)工藝如下：1、底物5-核苷二磷酸吡啶鹽的制備2、固定化多核苷酸磷酸化酶的制備（3）、固定化多核苷酸磷酸化酶，將分離純化的酶液滴加入冰浴中的載體，得到共價(jià)結(jié)合的固定化多核苷酸磷酸化。3、PolyI：C制備（1）底物預(yù)處理：CDP吡啶鹽轉(zhuǎn)成鋰鹽，IDP轉(zhuǎn)成鈉鹽。（2）酶促反應(yīng)：（每毫升反應(yīng)液含μmol／L數(shù)）IDP或CDP15；Tris150；MgC126；

EDTA1；聚合酶5單位，pH9.0，37℃，3～4小時(shí)。用鹽酸調(diào)pH1.5～2.0，使PolyI（或PolyC）沉淀，立即離心。此后在磷酸液沖液中溶解，等摩爾PolyI與PolyC混合，生成產(chǎn)品。（三）作用與用途本品具有抗病毒，抗腫瘤，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞免疫功能和抑制核酸代謝等作用。本品注入人體誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素。臨床已試用于腫瘤、血液病、病毒性肝炎及痘類毒性感染等多種疾患。六、胞二磷膽堿（CDP-膽堿）（Citicoline，CDP—choline，Cytidinediphosphocholine）

（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)胞二磷膽堿其化學(xué)名稱為胞嘧啶核苷-5＇-二磷酸膽堿鈉鹽本品為白色無定形粉末，易吸濕，易溶于水，幾不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多數(shù)有機(jī)溶劑。1％水溶液pH2.5～3.5，注射液pH7.0。（二）生產(chǎn)工藝1、酶合成法胞二磷膽堿由微生物菌體所提供的酶系催化胞苷酸和磷酸膽堿而合成，國內(nèi)使用啤酒生產(chǎn)中廢棄的酵母，反應(yīng)體系為：磷酸二氫鉀～氫氧化鈉緩沖液（pH8.0）200mol／ml，CMP20μmol／ml，磷酰膽堿

30μmol／ml，葡萄糖1000μmol／ml，MgSO4.7H2O20μmol／ml，酵母泥

550mg／m1。上述反應(yīng)體系于28℃保溫20小時(shí)，胞二磷膽堿對胞苷酸的收率為80％。2．粘性紅酵母發(fā)酵法國外發(fā)現(xiàn)一株粘性紅酵母可高產(chǎn)胞二磷膽堿。