《特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中氨基酸的測(cè)定 高效液相色譜法》

ICS67.050

CCSX80

CPPC

中國(guó)生產(chǎn)力促進(jìn)中心協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CPPCXXXX—XXXX

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中氨基酸的測(cè)定高

效液相色譜法

Determinationofaminoacidsinformulatedfoodsforspecialmedicalpurposeshigh-

performanceliquidchromatography

（征求意見(jiàn)稿）

在提交反饋意見(jiàn)時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)生產(chǎn)力促進(jìn)中心協(xié)會(huì)發(fā)布

T/CPPCXXXX—XXXX

目次

前言..............................................................................II

1范圍............................................................................1

2規(guī)范性引用文件..................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義......................................................................1

4原理............................................................................1

5檢驗(yàn)方法........................................................................1

6儀器與設(shè)備......................................................................1

7檢驗(yàn)步驟........................................................................1

8分析結(jié)果........................................................................3

9精密度..........................................................................3

10其他...........................................................................3

I

T/CPPCXXXX—XXXX

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由中國(guó)生產(chǎn)力促進(jìn)中心協(xié)會(huì)特醫(yī)食品與生物活性肽工作委員會(huì)提出。

本文件由中國(guó)生產(chǎn)力促進(jìn)中心協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)化工作委員會(huì)歸口。

本文件起草單位：XXX，XXX，XXX

本文件主要起草人：XXX，XXX

聲明：本文件的知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬于中國(guó)生產(chǎn)力促進(jìn)中心協(xié)會(huì)特醫(yī)食品與生物活性肽工作委員會(huì)，未經(jīng)

中國(guó)生產(chǎn)力促進(jìn)中心協(xié)會(huì)特醫(yī)食品與生物活性肽工作委員會(huì)同意，不得印刷、銷售。任何組織、個(gè)人使

用本文件開(kāi)展認(rèn)證、檢測(cè)等活動(dòng)應(yīng)經(jīng)中國(guó)生產(chǎn)力促進(jìn)中心協(xié)會(huì)特醫(yī)食品與生物活性肽工作委員會(huì)批準(zhǔn)

授權(quán)

II

T/CPPCXXXX—XXXX

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中氨基酸的測(cè)定高效液相色譜法

1范圍

本文件規(guī)定了特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中氨基酸的高效液相色譜測(cè)定方法。

本文件適用于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品蛋白質(zhì)組件中的16種氨基酸（天冬氨酸，絲氨酸，谷氨酸，脯

氨酸，羥脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，賴

氨酸，組氨酸，色氨酸）的測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用規(guī)格驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4原理

試樣中的氨基酸經(jīng)氫氧化鋰溶液水解，一級(jí)氨基酸用鄰苯二甲醛（OPA）、二級(jí)氨基酸用9-芴甲基

氯甲酸酯（FMOC）進(jìn)行衍生，用具有紫外檢測(cè)器/二極管陣列檢測(cè)器的高效液相色譜檢測(cè)。

5檢驗(yàn)方法

外標(biāo)法定量。

6儀器與設(shè)備

6.1天平:感量0.0001g、感量0.001g。

6.2聚四氟乙烯水解管:配襯管和密封墊。

6.3恒溫干燥箱:可達(dá)到110℃±2℃。

6.4離心機(jī):轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。

6.5高效液相色譜儀:配自動(dòng)進(jìn)樣器及紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。

7檢驗(yàn)步驟

7.1樣品準(zhǔn)備

平行做兩份試驗(yàn)，稱取樣品50-100mg（精確至0.0001g），置于聚四氟乙烯水解管襯管中，加1.5mL

氫氧化鋰溶液，充氮1min，旋緊密封蓋后放入110℃±2℃恒溫干燥箱中，水解20h，取出水解管，冷卻

至室溫，用乙酸鈉緩沖溶液將水解液定量轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，并用上述緩沖溶液定容，離心或過(guò)0.45

um濾膜過(guò)濾，液相色譜測(cè)定。

7.2試劑準(zhǔn)備

除特殊注明外,本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純。

1

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7.2.1水:符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)定。

7.2.2甲醇:色譜純。

7.2.3乙腈：色譜純。

7.2.4氫氧化鉀溶液(0.1mol/L):稱取0.56g氫氧化鉀,溶解于100mL水中,即得。

7.2.5氫氧化鋰溶液(4mol/L):稱取83.9g氫氧化鋰,溶解于500mL水中,即得。

7.2.6乙酸鈉緩沖溶液(0.0085mol/LNa+,pH=4.5):稱取0.70g無(wú)水乙酸鈉，溶解于1000mL水中,用

冰乙酸調(diào)節(jié)pH為4.5。

7.2.7流動(dòng)相溶液A：含10mM磷酸氫二鈉，10mM硼酸鈉的緩沖溶液，用鹽酸調(diào)pH至8.2。

7.2.8流動(dòng)相溶液B：甲醇：乙腈：水（45:45:10，體積比）。

7.3氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

分別稱取所需測(cè)定的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1N鹽酸溶液配制成濃度為1000nmol/mL溶液，并逐級(jí)稀釋

為50,100,250,500nmol/mL的工作溶液。

7.4衍生化試劑

7.4.1硼酸鹽緩沖試劑：0.4M濃度pH10.2的硼酸鹽水溶液。

7.4.2FMOC試劑：FMOC溶解于0.4M硼酸鹽緩沖溶液和3-巰基丙酸中，配成2.5mg/mL濃度。

7.4.3OPA試劑：OPA溶解于0.4M硼酸鹽緩沖溶液和3-巰基丙酸中，配成10mg/mL濃度。

7.4.4樣稀釋劑：100mL流動(dòng)相A中加入1.2mL濃磷酸。

7.5液相色譜條件

7.5.1液相色譜儀：InfinityLC1260。

7.5.2液相色譜柱：PoroshellHPH-C18，4.6×100mm，2.7μm。

7.5.3柱溫：40℃。

7.5.4流速：1.5mL/min。

7.5.5流動(dòng)相A：含10mM磷酸氫二鈉，10mM四硼酸鈉的緩沖溶液，用鹽酸調(diào)pH至8.2。

7.5.6流動(dòng)相B：甲醇：乙腈：水（45:45:10）；梯度洗脫。

7.5.7檢測(cè)器338nm,10nm帶寬;參比390nm,20nm帶寬（一級(jí)氨基酸）。

7.5.8262nm,16nm帶寬;參比324nm,8nm帶寬（二級(jí)氨基酸）。

7.5.9樣品衍生：按如下樣品衍生程序使用自動(dòng)進(jìn)樣器編程衍生。

7.5.10吸取緩沖溶劑->吸取OPA衍生試劑->吸取樣品->吸取FMOC衍生試劑->混合衍生->進(jìn)樣。

7.5.11按如下梯度表運(yùn)行色譜梯度

時(shí)間[min]A[%]B[%]C[%]D[%]流量[mL/min]最大壓力限值[bar]

0.0098.02.00.00.01.500600.00

0.3598.02.00.00.0--

13.4043.057.00.00.0--

13.500.0100.00.00.0--

15.700.0100.00.00.0--

15.8098.02.00.00.0--

18.0098.02.00.00.0--

2

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8分析結(jié)果

試樣中氨基酸的含量按公式(1)計(jì)算。

?×?×??

?=···········································································(1)