醫(yī)院培訓課件：《猴痘病毒實驗室檢測》

猴痘病毒實驗室檢測1

50nm全

球

流

行

情

況2https://worldhealthorg.shinyapps.io/mpx_global/1970第一例人感染猴痘病毒2022.5全球范圍內(nèi)持續(xù)增多的猴痘病例2022.7.23猴痘疫情構成“國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”2023.5.13猴痘疫情不再構成“國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”2022.9.16重慶報道我國第一例猴痘2023.6.6北京報道2例猴痘2023.6.10廣州報道2例猴痘歐洲美洲1958發(fā)現(xiàn)

猴痘病毒50nm相

關

指

南350nm生

物

學

特

性4痘病毒科，正痘病毒屬

猴痘病毒、天花病毒、痘苗病毒和牛痘病毒等形態(tài)結構：圓角磚形或卵圓形，大小為200nm×250nm，外周有30nm的外膜，環(huán)繞勻質(zhì)的核心體培養(yǎng)特性：在人、猴、鼠、兔等來源的細胞和雞胚絨毛尿囊膜中生長良好并引起細胞病變Mpoxvirus生

物

學

特

性全長約為197kb的雙鏈DNA病毒基因組未端為長約6kb的反向重復序列，呈發(fā)夾環(huán)結構190個開放讀碼框特異性基因片段：F3L、B6R、ATl、G2R等YudaChen,ChangchengWu,RuhanA,etal.Perspectiveontheapplicationofgenomesequencingfor

monkeypox

virussurveillance.VirologicaSinica.2023,38(2）：327-333.生

物

學

特

性CladeII（死亡率約3.6%）

CladeI（死亡率約10.6%）西非分支cladeII剛果盆地分支cladeI生

物

學

特

性7耐干燥和低溫在土壤、痂皮和衣被上可生存數(shù)月該病毒對熱敏感，加熱至56℃30分鐘或60℃10分鐘即可滅活紫外線和一般消毒劑均可使之滅活，對次氯酸鈉、氯二甲酚、戊二醛、甲醛和多聚甲醛等敏感流

行

病

學宿主：猴痘病毒的主要宿主為非洲嚙齒類（非洲松鼠、樹松鼠、岡比亞袋鼠、睡鼠等），靈長類（多種猴類和猿類）由于與感染的嚙齒類動物接觸偶可感染。傳染源：

感染動物及猴痘病毒感染者是主要傳染源。流

行

病

學傳播途徑：病毒經(jīng)黏膜和破損皮膚侵入人體。接觸感染動物的呼吸道分泌物、病變滲出物、血液、其它體液，或被感染動物咬傷、抓傷而感染。人與人之間主要通過密切接觸傳播，亦可在長時間近距離接觸時通過飛沫傳播，接觸病毒污染的物品也有可能感染。母嬰傳播。流

行

病

學易感人群：未接種過天花疫苗的人群對猴痘病毒普遍易感。既往接種過天花疫苗者對猴痘病毒存在一定程度的交叉保護力。臨

床

癥

狀潛伏期：5～21天，多為6～13天。癥狀：前驅期---發(fā)熱（38.5℃以上）、寒戰(zhàn)、頭痛、嗜睡、乏力、背

部疼痛和肌痛、淺表淋巴結腫大等。皮疹期---斑疹、丘疹、皰疹、膿皰和結痂。ReedKD,MelskiJW,GrahamMB,etal.ThedetectionofmonkeypoxinhumansintheWesternHemisphere.NEnglJMed.2004Jan22;350(4):342-50.12高致病性病毒實

驗

室

檢

測《人間傳染的病原微生物名錄》——第一類生物危害涉及活病毒的樣本滅活操作在生物安全三級（BSL-3）及以上實驗室的生物安全柜內(nèi)進行滅活樣本病毒的DNA提取可在生物安全二級（BSL-2）實驗室（個人三級防護）采集雙份樣本，一份滅活，一份非滅活。實

驗

室

檢

測13一、樣本采集、保存和運輸1.采樣人員個人防護裝備要求N95或以上防護口罩、護目鏡或面罩、連體防護服、雙層乳膠手套、防水靴套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應及時更換外層乳膠手套。實

驗

室

檢

測14一、樣本采集、保存和運輸2.標本采集種類（1）皮膚病變標本（痘皰液、病變皮疹、痘皰表皮或痘痂、痘皰表面和/或滲出物的拭子）（2）急性期呼吸道標本（咽拭子）（3）血液標本（急性期、恢復期雙份血清。第一份血清最好在發(fā)病后7天內(nèi)釆集，第二份血清應在發(fā)病后第3～4周釆集。）（4）其他材料（直腸和/或生殖器拭子、尿液、精液等）實

驗

室

檢

測15一、樣本采集、保存和運輸3.標本采集方法（1）病變皮疹、痘皰表面和/或滲出物的拭子：使用無菌聚酯或滌綸拭子用力涂抹病變部位，以確保收集足夠的病毒DNA，將拭子放置無菌收集管中。實

驗

室

檢

測16一、樣本采集、保存和運輸3.標本采集方法（2）痘皰液:用酒精棉球對皮損處進行消毒，并自然干燥。用無菌針頭和注射器吸取液體，放置于1.5至2毫升的無菌帶O型橡膠圈的螺旋蓋塑料管。實

驗

室

檢

測17一、樣本采集、保存和運輸3.標本采集方法（3）皮疹或痘皰表皮、皮疹內(nèi)液體拭子采集：用酒精棉球對皮損處進行消毒，并自然干燥。用一次性手術刀（或無菌26號針頭）打開并移除小泡或膿皰的頂部皮膚，將小泡頂部皮膚放置于1.5至2毫升的無菌帶O型橡膠圈的螺旋蓋塑料管中。用無菌聚酯或滌綸拭子擦拭皮損底部，將拭子放置于無菌收集管中。實

驗

室

檢

測18一、樣本采集、保存和運輸3.標本采集方法（4）痘痂或硬皮:用酒精棉球對皮損處進行消毒，并自然干燥。用無菌26號針頭或剪刀取至少4塊痂皮，每塊痂皮要來自不同的身體部位。將痂皮放置于1.5至2毫升的無菌帶O型橡膠圈的螺旋蓋塑料管中。實

驗

室

檢

測19一、樣本采集、保存和運輸3.標本采集方法將兩個相同類型的病變標本收集在一個管中，最好是從身體的不同部位收集的，且外觀不同。不同類型病變（如痘皰液和痘痂）不能放在同一管中。采樣時建議采雙份樣本，一管用滅活型病毒采樣管，另一管為無菌螺旋蓋管（無液體）（因猴痘病毒在干燥環(huán)境中比較穩(wěn)定）。實

驗

室

檢

測20一、樣本采集一、樣本采集、保存和運輸3.標本采集方法（5）咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，將拭子放入無菌采樣管中，尾部棄去，旋緊管蓋。實

驗

室

檢

測21一、樣本采集、保存和運輸3.標本采集方法（6）血液標本：盡量釆集急性期、恢復期雙份血清。第一份血清應盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）釆集，第二份血清應在發(fā)病后第3～4周釆集。采集量5ml，以空腹血為佳，EDTA抗凝。室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，分別收集血漿和血液中細胞于無菌螺口塑料管中。實

驗

室

檢

測22一、樣本采集、保存和運輸4.標本運輸標本應在收集后一小時內(nèi)冷藏（2～8℃）或冷凍（-20℃或更低），并盡快進行檢測。能在一周以內(nèi)檢測的標本可置于4℃保存。暫時無法檢測的標本，短期可在-20℃中保存，長期應置于-70℃以下保存（收集后>60天）。實

驗

室

檢

測23一、樣本采集、保存和運輸5.標本送檢（1）上送標本：病例標本先由省級及以下疾控機構進行初步檢測，猴痘陽性標本送中國疾控中心病毒病所復核。（2）運輸：UN2814，準運證書實

驗

室

檢

測24二、實驗室檢測實

驗

室

檢

測25三、核酸檢測試劑準備核酸提取結果分析報告樣本前處理核酸擴增實

驗

室

檢

測26三、核酸檢測1.試劑準備商品化試劑盒合成引物探針對照陰性對照（水）陽性對照（涵蓋檢測部位序列的質(zhì)粒）儲備2個及以上廠家試劑盒，相互驗證。實

驗

室

檢

測27三、核酸檢測2.樣本前處理（1）痘皰液：將痘皰液用適當體積的含PS的PBS或DMEM重懸：

100μL樣本+80μL緩沖液，總量為180μL。樣本不足100μL時用緩沖液補足至總量180μL。實

驗

室

檢

測28三、核酸檢測2.樣本前處理（2）病變皮疹或痘痂：取1塊痂皮按質(zhì)量/體積（1mg:5μL）加入相應體積含PS的PBS，研磨或勻漿處理，取80μL，然后加入100μL緩沖液。滅活型采樣管對痘痂、痘皮組織中病毒滅活效果可能仍比較差，且在核酸提取過程中需要對樣本進行粉碎處理，因此不建議在BSL-2實驗室處理痘痂和痘皮樣本。實

驗

室

檢

測29三、核酸檢測2.樣本前處理（3）咽拭子、其它拭子：若拭子在樣本保存液中可直接取200μL樣本，若為干拭子可用3ml含PS的PBS或DMEM重懸，然后取200μL樣本。（4）全血或血清：直接取200μL樣本。實

驗

室

檢

測30三、核酸檢測3.核酸提取組織基因組DNA提取試劑盒血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒實

驗

室

檢

測31三、核酸檢測4.核酸擴增（1）反應體系實

驗

室

檢

測32三、核酸檢測4.核酸擴增（2）反應程序選擇Fam熒光信號檢測通道，收集設在60℃。實

驗

室

檢

測33三、核酸檢測（1）結果分析閾值設定:基線取3-10或6-15個循環(huán)的熒光信號。閾值設定原則為閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線最高點，也可根儀器噪音情況調(diào)整閾值。5.結果分析實

驗

室

檢

測34三、核酸檢測（2）Real-timePCR反應系統(tǒng)的質(zhì)量控制：反應結果應同時符合以下2個條件，否則試驗結果無效，應重新開展檢測。陰性對照無擴增，為陰性。陽性對照未出現(xiàn)陰性結果。5.結果分析實

驗

室

檢

測35三、核酸檢測（3）結果判定：A.陰性：雙孔Ct>37，或無Ct值；B.灰區(qū)：一孔Ct值>37；C.陽性：雙孔Ct值<37。5.結果分析實

驗

室

檢

測36三、核酸檢測5.結果分析陽性結果：所有陽性和處于灰區(qū)的樣本應重復檢測或經(jīng)序列分析進行確診。建立復檢流程。陰性結果：當樣本僅為咽拭子或血清、血漿時，且檢測結果為陰性時，應結合臨床癥狀，慎重做出陰性診斷。實

驗

室

檢

測37三、核酸檢測6.鑒別診斷主要和其他發(fā)熱出疹性疾病鑒別：水痘、帶狀皰疹、單純皰疹、麻疹、登革熱等。實

驗

室

檢

測38四、測序分析13文庫構建2數(shù)據(jù)分析4核酸提取上機測序實

驗

室

檢

測39四、測序分析/gwh/poxvirus//hmpxv-variants//

ReconstructedancestralMPXV(ancestral)HumanMonkeypox(hMPXV)——MPXV-M5312_HM12_Rivers(NC_063383.1)hMPXV_B1——MPXV_USA_2022_MA001inNC_063383coordinates(pseudo_ON563414)自定義參考株參考序列實

驗